含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)对白血病     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

人CD244基因转染细胞株的构建

目的构建稳定表达人CD244分子转基因细胞株。方法通过RT-PCR克隆人CD244基因,将人CD244基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD244和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞。结果成功克隆人CD244基因,并稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929/CD244。结论本研究成功构建了稳定表达人CD244的基因转染细胞株,为研究CD244生物学功能奠定了基础。     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

目的：构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3（ζ）和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果：经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论：应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

iNOS基因重组逆转录病毒的包装及高滴度病毒液的制备

目的利用逆转录病毒载体PLXSN介导iNOS基因转染,为逆转录病毒介导的iNOS转基因防治血管移植术后再狭窄的研究奠定实验基础。方法采用QIAGEN plasmid Maxi Kit纯化PLXSN-iNOS;通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSN-iNOS导入包装细胞PA317中;经G418筛选获得抗性克隆,命名为PA317/iNOS;提取抗性克隆细胞基因组DNA,用PCR进行鉴定;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。结果PA317/iNOS细胞能稳定合成和分泌重组逆转录病毒颗粒,并在约142 bp处扩增出特异的片段;PLXSN-iNOS病毒上清的最高滴度为1.6×106CFU/mL。结论逆转录病毒载体PLXSN能有效介导iNOS基因的转染。     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

Endostatin基因转染人脐带血CD34+ 造血干细胞的实验研究

目的检测人endostatin(血管内皮抑制素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞后的表达和分泌情况.方法电穿孔法将Plncx/endo转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆后用NIH3T3细胞测定病毒的滴度,RT-PCR法测定耐药的包装细胞中是否存在endostatin基因.取新鲜人脐带血40～80 ml,用Ficoll分离出单个核细胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞,流式细胞仪(FCM)检测CD34+造血干细胞的浓度和纯度.将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共同培养72 h,应用RT-PCR及Western blot检测人endostatin的表达和分泌.结果 Plncx/endo质粒克隆扩增后,经酶切鉴定有endostatin基因存在.RT-PCR证实,转染人endostatin基因的PA317/endo、NIH3T3/endo细胞中存在人endostatin特异性片段,病毒滴度为1.3×105 cfu·ml-1.FCM检测,CD34+干细胞在脐血中的初始含量＜5%,经Mini-MACS分离纯化后纯度超过90%.从1×108的界面细胞平均可以分离获得(5～20)×105CD34+个干细胞.RT-PCR证实,脐带血CD34+/endo造血干细胞基因组中含有人550 bp endostatin特异性片段, Western blot分析显示人endostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌.结论逆转录病毒可以介导endostatin基因转导人脐带血CD34+造血干细胞并表达endostatin蛋白.     

NIH3T3细胞中前脑啡肽原基因的稳定表达

目的:利用重组逆转录病毒载体pLNCX2-pENK,研究pENK基因在NIH3T3细胞中是否能够稳定表达.方法:用pLNCX2-pENK转染病毒包装细胞PT67,其病毒上清液感染NIH3T3细胞,检测pENK基因是否整合人NIH3T3细胞基因组中并通过RT-PCR及放射免疫法检测基因表达情况.结果:病毒基因组整合到NIH3T3细胞基因组中,并检测到目的基因转录及蛋白表达.结论:用逆转录病毒载体能将pENK基因整合到靶细胞NIH3T3基因组中,且该基因能长期稳定表达,为慢性疼痛的进一步治疗奠定了基础.     

趋化因子受体CXCR4反义RNA重组表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的:构建趋化因子受体CXCR4反义 RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中获得目的基因,并以正、反两个方向定向插入到逆转录病毒载体pLXSN.重组载体用脂质体转染剂 (lipofectAMINE)转染PA317包装细胞,抗G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR(fluorogenic-quantitative PCR,FQ-PCR)测定假病毒滴度,进一步感染NIH/3T3 细胞. 结果: CXCR4正、反义RNA 的真核表达载体,经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞,目的基因在该细胞中得到整合与表达.结论:从PBMCs中获得的目的基因通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达,为进一步研究CXCR4反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础.     

病毒包装细胞PA317/HGSTπ的建立

目的建立产逆转录病毒的PA317/HGSTπ细胞株,为进一步把耐药基因GSTπ导入造血干细胞以逆转卵巢癌化疗药物对骨髓的毒副作用的研究奠定基础.方法用限制性内切酶HpaⅠ、BamhⅠ分别双酶切质粒pLXSH-GSTπ和pLXSN,回收GSTπ小片段和pLXSN大片段,在T4连接酶的作用下,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-GSTπ;酶切鉴定后用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选获得抗性克隆,用Hela细胞测定病毒滴度.结果 (1)酶切证实pLXSN-GSTπ和pLXSH-GSTπ的目的片段完全一致,表明重组质粒构建成功;(2)G418筛选获得多个抗性克隆,Hela测定病毒滴度最高为2.2×103CFU/ml.结论本研究成功建立了产病毒包装细胞株PA317/HGSTπ,该细胞株能产生含有耐药基因GSTπ的逆转录病毒,为进一步将HGSTπ应用于卵巢癌的大剂量化疗中奠定了良好的基础.     

人CD48基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD48基因,构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人CD48基因,将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,进而感染L929细胞,构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。结果成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体,进而成功获得稳定表达人CD48的基因转染细胞株L/CD48。结论成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体,并构建了稳定表达CD48分子的基因转染细胞株,为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

抗CD20单链抗体-CD8-TCRζ融合基因转染的T细胞治疗人B细胞淋巴瘤的实验研究

目的:观察抗CD20单链抗体(single chain variable fragment,scFv)-CD8-TCRζ融合基因转染的T淋巴细胞在体内 外的抗人B细胞淋巴瘤作用,探讨利用CD20介导自体T淋巴细胞杀伤人B细胞淋巴瘤的可行性.方法:构建包含抗CD20scFv、CD8分子和CD3信号转导链ζ的融合基因,将其克隆入载体pcDNA3中,酶切鉴定正确后电转染入人外周血T淋巴细胞,诱导其表达抗CD20 scFv-CD8-TCRζ融合蛋白.流式细胞仪检测基因修饰后人T淋巴细胞结合CD20蛋白的功能;细胞杀伤试剂盒检测基因修饰后T淋巴细胞体外杀伤人B细胞淋巴瘤Raji细胞的能力;并在BALB/c裸鼠体内观察其对人B细胞淋巴瘤移植瘤的抑制效应.结果:成功构建、转染了抗CD20 scFv-CD8-TCRζ融合基因,并在人T淋巴细胞表面成功表达;流式细胞仪和细胞杀伤试剂盒检测结果表明经基因修饰后的人T淋巴细胞能特异性结合CD20抗原,并能特异性地杀伤人B细胞淋巴瘤Raji细胞,在裸鼠体内显著地抑制人B细胞淋巴瘤移植瘤的生长.结论:抗CD20 scFv-CD8-TCRζ融合基因转染的T淋巴细胞在体内外均能杀伤人B细胞淋巴瘤细胞,为进一步应用人T淋巴细胞杀伤作用治疗人B细胞淋巴瘤奠定了基础.