氯霉素ELISA可视化微阵列芯片检测试剂盒评价研究

为了了解氯霉素ELISA可视化微阵列芯片检测试剂盒的有效性和可靠性,从灵敏度、特异性、准确度、可重复性、检出限、耐变性、批间变异等方面进行了评价,结果表明该试剂盒在测试范围内线性回归良好,相关系数R2可达0.9943,与结构相似的甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率均小于1%,批间变异系数小于20%,牛奶中的平均回收率为108.5%,检出限为0.067μg/L,该试剂盒有较好的准确性、特异性与重复性,耐变性与批间变异均在可接受范围内,可用于牛奶样品中氯霉素的残留检测。     

三聚氰胺单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

采用牛血清白蛋白偶联的三聚氰胺( melamine- BSA)完全抗原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术制备抗三聚氰胺的特异性单克隆抗体.所得单克隆抗体效价可达5.0×105,且抗体的亚类类型为IgG1,抗体的亲和常数为3.21×109 L/mol.与三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺的交叉反应率分别为30％、93％和46％.说明该单抗可用于三聚氰胺类物质的检测,为研制高质量的三聚氰胺ELISA试剂盒和胶体金试纸条奠定了基础.     

氯霉素ELISA检测试剂盒评价技术

酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒作为多种实验要素的集合,已经广泛应用于日常检测和实验研究中。为了解国产氯霉素试剂盒的有效性和可靠性,选择一种市售试剂盒,从灵敏度、特异性、准确度、重复性、检出限、耐变性、批间变异等多个角度对其进行了技术评价。该试剂盒在测试范围内线性回归良好,相关系数R2可达0.9945,与结构相似的棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率均小于0.1%,批间变异系数小于20%,鸡肉、虾肉的平均回收率为100.9%、100.7%,相应的检测限是0.077、0.128ng/mL,可以满足"2012年度动物及动物产品兽药残留监控计划"的限量标准(0.3ng/mL)要求。     

三聚氰胺单克隆抗体的制备及鉴定

为建立三聚氰胺免疫分析方法,采用戊二醛法合成免疫抗原MEL-BSA和包被抗原MEL-OVA,全抗原经紫外吸收法检测证实偶联成功且偶联比约为16∶1。用MEL-BSA免疫BALB/c小鼠,用常规单克隆制备技术筛选获得1株稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的细胞株6E3。腹水经纯化后,研究了抗体效价、竞争抑制能力及与结构类似物的交叉反应率,其中抗体效价为1∶64 000,检测线性范围为0.1~3.2 mg/L,IC50为1.01 mg/L,与三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺及三聚氰酸二酰胺的交叉反应率均小于0.1%,该方法有望用于三聚氰胺免疫检测试剂的研制开发。     

3种β-兴奋剂化学发光酶免疫试剂盒分析检测方法的评价

选取3种市售β-兴奋剂化学发光酶免疫分析检测试剂盒,从线性关系、灵敏度、选择性、检出限、准确度、重复性及变异性等方面进行实验,并经农业部1025号公告—18—2008中高效液相色谱—串联质谱法验证比较,初步建立了一套化学发光酶免疫分析检测试剂盒质量评价方法。结果表明:沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺3种试剂盒在测定范围内线性关系良好,灵敏度分别为0.7、1.8、1.0 ng/mL,检出限分别为0.2、0.1、0.2 ng/mL,猪肝、猪肉和牛肉的回收率在81.9%~115.2%之间,重复性变异系数为3.3%~9.7%,批间变异系数为9.9%~16.5%,交叉反应率均符合产品说明书要求,可以用于猪肝、猪肉、牛肉样品中沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的残留检测。     

三重四极杆气质联用法分析乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺

建立三重四极杆气相色谱质谱联用分析乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的方法。样品以甲醇提取,利用衍生化试剂BSTFA-TMCS(99:1,V/V)进行衍生化处理、优化仪器条件、考察基质效应,利用三重四极杆气质联用的多反应监测(MRM)技术,对三聚氰酸和三聚氰胺衍生物进行定性定量分析,以三聚氰酸衍生物离子对m/z345>215、m/z345>330离子对进行定性,以m/z345>215进行定量;以三聚氰胺衍生物离子对m/z342>171、m/z342>327离子对进行定性,以m/z342>327进行定量。方法在0.010～0.500mg/L范围内呈良好的线性关系。方法分析三聚氰酸和三聚氰胺的检测限分别为0.016、0.003mg/kg,精密度为4.5%～8.6%、3.9%～6.2%和回收率分别为84.0%～102.0%、88.5%～104.0%。为乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的检测提供了准确可靠的方法。     

应用酶联免疫法检测鱼肉、蜂蜜中氯霉素的残留量

检测鱼、蜂蜜中氯霉素残留,以评价试剂盒性能为目的。用间接竞争酶联免疫分析法(ELISA法)对鱼肉、蜂蜜中的氯霉素残留量进行了测定。结果表明,标准曲线的R2为0.9943,线性方程y=-0.3668x+0.4353,IC50为0.71μg/L,线性范围为0.05～4.05 ng/mL。鱼肉和蜂蜜中的检测限分别为0.126μg/kg和0.081μg/kg。鱼肉和蜂蜜的添加回收率分别大于88.1%和85.5%,批内变异系数分别小于15.8%、13.6%,批间变异系数小于15.5%、12.3%。与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应率为152.63%,与其他药物的交叉反应率均小于0.01%。该法测定氯霉素灵敏准确,重复性好,特异性高,适合用于检测鱼肉、蜂蜜中的氯霉素残留。     

钛胶正相高效液相色谱法同时分析三聚氰胺和三聚氰酸

建立了同时分析液态奶、自来水和游泳池水中三聚氰胺和三聚氰酸的钛胶正相高效液相色谱法。色谱条件:分离柱为Titania Sachtopore-NP柱(250mm×4.6mm×5μm),流动相为水∶甲醇=50∶50(V/V)、流动相中含醋酸盐1.0mmol/L、pH7.0、流速0.8mL/min、柱温60℃、UV检测波长210nm。三聚氰胺和三聚氰酸分别在0.1～10μg/mL和2～100μg/mL范围内与对应的峰面积呈良好的线性关系,检出限分别为0.02μg/mL和0.1μg/mL,本方法三聚氰胺的回收率为94.8%～111.7%,三聚氰酸回收率为103.9%～114.3%,三聚氰胺和三聚氰酸测定结果的相对标准偏差分别为0.62%和0.78%(n=8)。     

盐酸克伦特罗的AlphaLISA检测方法的建立

目的采用纳米均相时间分辨荧光免疫技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay,AlphaLISA)建立高灵敏检测盐酸克伦特罗(clenbuterol,CLB)残留的方法。方法在发光微粒上固定CLB,与游离的CLB共同竞争固定在感光微粒上的CLB单克隆抗体,优化检测条件并进行方法学考核。结果该方法的灵敏度为0.04 ng/mL。猪肉样品回收率在83%~109%之间,牛肉样品回收率在92%~112%之间;猪肉样品检测的批内变异系数CV10%、批间变异系数CV15%。与特布他林、沙丁胺醇的交叉反应率分别为34.5%、25.7%,与莱克多巴胺、妥布特罗、齐帕特罗无交叉反应。结论 CLB-AlphaLISA检测肉类中克伦特罗残留具有简单、快速、灵敏性高、特异性强、稳定等特点,具有广阔的应用前景。     

乳粉中阪崎肠杆菌污染检测试剂盒的研制

目的：以乳粉中污染的阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）为检测目标,开发一种能快速检测其污染的试剂盒。方法：以两株阪崎肠杆菌单克隆抗体分别为包被抗体和检测抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附实验方法,优化各个反应条件,制成在2 h内能发生显色反应的检测试剂盒。结果：包被抗体的最佳工作质量浓度为10 μg/mL,检测抗体的最佳稀释倍数为1∶5 000。试剂盒的检测限为104 CFU/mL,在104～108 CFU/mL范围内OD450 nm值与阪崎肠杆菌浓度的常用对数值呈线性关系。特异性实验中,试剂盒可检出3 株阪崎肠杆菌标准菌株,对其他9 株食品中常见致病菌的检测均呈阴性。模拟带菌实验中,初始菌浓度为1 CFU/mL的模拟样品经过8 h前增菌后,通过该试剂盒便可检出。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于6%,至少可在室温保存6 个月。结论：该双抗体夹心试剂盒具有灵敏度高、特异性好、精密度高、稳定性强等优点,可应用于乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

HPLC-MS/MS同时检测大鼠体内三聚氰胺和三聚氰酸含量

目的建立HPLC-MS/MS同时检测大鼠血浆和组织中三聚氰胺和三聚氰酸含量的方法。方法以同位素标记的三聚氰胺和三聚氰酸作为内标物,大鼠血浆和组织经二氯甲烷-乙腈前处理后,经色谱柱分离,串联离子阱质谱采用ESI源按运行时间段切换正、负离子模式进行测定。结果在0.3～75μg/ml范围内,三聚氰酸和三聚氰胺具有良好的线性(r≥0.998)。在0.9、5.0、50μg/ml的给药大鼠的血浆样本中,三聚氰酸和三聚氰胺的回收率分别为97.4%～99.4%、96.8%～98.9%,两者的变异系数为2.43%～6.35%(日内)、1.70%～4.12%(日间)和0.30%～9.17%(日内)、0.75%～3.39%(日间);在0.9、5.0、50μg/ml的给药大鼠肝组织样本中,三聚氰酸和三聚氰胺的回收率分别为90.8%～104.6%、91.7%～106.0%,对应的变异系数为3.70%～5.14%(日内)、2.84%～4.50%(日间)和1.31%～2.21%(日内)、1.12%～3.36%(日间)。结论该方法样品前处理简单,基质干扰小,分析效率高,具有良好的精密度、准确度和特异性,是进行三聚氰酸、三聚氰胺在动物体内的组织代谢和毒性研究的理想分析方法。     

己烯雌酚残留检测ELISA试剂盒的研制及应用

在实验室前期制备的己烯雌酚多克隆抗体基础上建立间接竞争ELISA检测方法,研制出己烯雌酚残留ELISA快速检测试剂盒,并对其性能参数进行测定。结果表明,所选用的抗体对己烯雌酚亲和力高,除了与双烯雌酚、己烷雌酚的交叉反应率分别为6.83%和2.56%外,与其他结构类似物或功能类似物交叉反应率均小于0.01%;己烯雌酚残留检测的标准曲线为y=-28.71x+59.37,R2为0.9895,线性范围为0.08~8.17ng/mL,检测限IC10为0.05ng/mL,灵敏度IC50为1.09ng/mL,样品的加标回收率为80.04%~107.91%,平均批内和批间变异系数分别为6.41%和8.83%;与HPLC测定方法比对具有较高的相符性,相关系数R2为0.9882;该试剂盒在4℃下至少可保存6个月,可用于批量猪肉、鸡肉、鱼肉、饲料等样品中己烯雌酚残留的检测。     

三聚氰胺ELISA试剂盒在食品检测中的检测效果研究

目的为验证本公司生产的三聚氰胺ELISA检测试剂盒的检测效果。方法用酶联免疫法对牛奶、奶粉、鸡肉和鸡蛋等4种样品中三聚氰胺的残留量进行检测,并与高效液相色谱法进行对照。结果结果表明:该试剂盒对4种样品的最低检测限分别为19.22、46.86、51.64、21.38μg/kg,试剂盒板内板间变异系数均小于10%;对4种样品做加标回收试验,其回收率均在95%~120%之间,变异系数均小于10%;该方法与高效液相色谱法检测实际样品的阴、阳性判断结果一致。结论该方法稳定、可靠,可满足食品中三聚氰胺残留快速检测的需要。     

盐酸克仑特罗ELISA试剂盒的研制

在间接竞争酶联免疫吸附法的基础上,研制了一种可以检测尿样或食品中盐酸克仑特罗的试剂盒。ELISA检测方法的各个影响因素均通过实验进行了优化。该试剂盒具有良好的灵敏度,半抑制率(IC50)为0.6ng/ml,该抗体与肾上腺素等结构类似物的交叉反应率均小于0.3%,回收率为90%～104%,批内变异系数小于6%,批间变异系数小于10%,试剂盒在12个月保存期内稳定。可用于盐酸克仑特罗的快速定量检测。     

甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

研制用于检测甲拌磷残留量的间接竞争ELISA试剂盒。甲拌磷包被抗原的最佳工作质量浓度为4mg/L,抗体的最佳稀释倍数为8000,甲拌磷多克隆抗体交叉反应率小于20%,甲拌磷抑制率回归曲线为y=18.846x＋6.9949,在1～5000μg/L范围内呈线性关系,检测限为4.90μg/L,IC50为191.37μg/L。甲拌磷试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或－20℃下有效期为270d。     

日落黄酶联免疫试剂盒的制备及应用

为了快速准确检测食品中的日落黄,本研究通过羰基二咪唑法,将日落黄与载体蛋白偶联,并使用紫外光谱进行鉴定,结果显示日落黄检测抗原和免疫抗原成功合成;通过免疫小鼠制备了效价高达1:64000以上的抗日落黄单克隆抗体,研制了日落黄ELISA检测试剂盒。试剂盒性能检测分析结果显示,试剂盒标准曲线的线性检测范围为62.50～1000 ng/mL,检测限为1.50 ng/mL,检测灵敏度IC_(50)值为6.50 ng/mL;试剂盒中,用于检测的单克隆抗体对日落黄的交叉反应率为100%,对诱惑红有弱交叉反应,反应率为2%,与其他2种色素添加剂未见交叉反应;检测市售果汁、水果罐头和果冻类样品的批内、批间回收率分别为89.18%～101.13%、87.69%～97.90%,且批内、批间试验的相对标准偏差均小于10%,说明试剂盒具有良好的灵敏度和准确性,且操作方便快捷。本研究应用免疫学方法成功地制备了日落黄酶联免疫试剂盒,并检测了水果类制品中添加的日落黄,为大批量测定食品中日落黄含量提供了高效准确的实验方法。     

沙门氏菌核酸检测试剂盒的评价

采用室内技术参数验证和协同实验的方式对商品化沙门氏菌核酸检测试剂盒在食品中沙门氏菌核酸检测上的包容性、排他性、灵敏度、特异性、准确度、检测限、耐变性、批间变异进行评价。评价结果表明,试剂盒检测结果与国家标准方法检测结果总体上无显著差异,能满足食品样品的检测要求;但对蔬菜制品的灵敏度较其他食品低,与国家标准方法有显著差异,因此该商品化试剂盒不适用于蔬菜制品中沙门氏菌核酸的检测。     

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法 以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记的抗原与标准品（或样品）中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系。结果 以三聚氰胺为标准品建立标准曲线,得到方法的IC50为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9-35μg/L;检测样品的回收率为70.0%-127.9%,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论 本方法灵敏度高、特异性强、检测快速, 可以满足实际样品的检测需求。     

单增李斯特氏菌商品化核酸检测试剂盒评价

通过实验室内确认和实验室间协同实验对商品化单增李斯特氏菌LAMP试剂盒进行适用性评价,选择具有代表性的5大类15个细类食品基质,对剂盒方法包括灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率、相对准确度、检出限、耐变性以及批间变异8项定性方法性能指标进行实验室内评估。并对10家实验室的协同实验结果进行评价。试剂盒检测结果与基准方法 GB 4789.30-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》检测结果上无显著差异,能基本满足食品样品的检测要求,但蔬菜制品类的商品化核酸试剂盒法灵敏度仅为5%、假阴性率高达95%、相对准确率为68%,且与基准法检测阳性确证比在5%的置信区间内存在统计学差异,因此不适用于蔬菜制品的检测。10家实验室对3个接种水平样本的检测,特异性、灵敏度以及相对准确度均为100%,因此LAMP试剂盒检测法结果稳定可靠。     

高效液相色谱法快速测定乳粉中的三聚氰胺与双氰胺

建立高效液相色谱-二极管阵列检测器同时检测乳粉中三聚氰胺和双氰胺的分析方法。采用1%三氯乙酸溶液提取样品中的三聚氰胺和双氰胺,氨基柱为分析柱,流动相为乙腈-水（75∶25,V/V）,流速1.0 mL/min,检测波长233 nm。2 种物质在0.005～60 mg/L范围内与其峰面积线性关系良好,不同添加水平的回收率在83.2%～102.6%,三聚氰胺和双氰胺的方法定量限分别为0.17、0.15 mg/kg,方法变异系数为2.3%～7.2%（n=6）。此方法操作简便、快速、成本低,适用于乳粉中三聚氰胺和双氰胺的同时检测。