三聚氰胺单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

采用牛血清白蛋白偶联的三聚氰胺( melamine- BSA)完全抗原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术制备抗三聚氰胺的特异性单克隆抗体.所得单克隆抗体效价可达5.0×105,且抗体的亚类类型为IgG1,抗体的亲和常数为3.21×109 L/mol.与三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺的交叉反应率分别为30％、93％和46％.说明该单抗可用于三聚氰胺类物质的检测,为研制高质量的三聚氰胺ELISA试剂盒和胶体金试纸条奠定了基础.     

牛奶中三聚氰胺的ELISA检测研究

戊二醛法将三聚氰胺(Melamine)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原Melamine-BSA及包被抗原Melamine-OVA.对人工合成抗原进行紫外扫描,其紫外扫描谱图与载体蛋白及三聚氰胺的图谱有明显的差异,初步显示载体蛋白与三聚氰胺偶联成功.进一步分析Melamine-BSA中Melamine与BSA的摩尔比,复合物中三聚氰胺与BSA的摩尔比为8.56 ∶ 1.用免疫抗原Melamine-BSA腹腔免疫BALB/c小白鼠,获得抗三聚氰胺的多克隆抗体,间接非竞争ELISA分析所得抗血清的效价达10000以上.间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别三聚氰胺,与氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺无交叉反应.利用自制抗体建立牛奶中三聚氰胺的间接竞争ELISA检测方法,对奶样作0.1μg/mL,1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL,500μg/mL和1000μg/mL六个加标浓度的回收率在70.30%113.59%.     

氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

采用重氮化法合成氯霉素人工抗原.通过紫外扫描、凝胶电泳、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MAL-DI-TOFMS)鉴定人工抗原.用该人工抗原免疫兔子,获得多抗血清.采用酶联免疫法测定抗体效价,并对ELISA条件进行初步优化.选择与氯霉素结构相似的4种药物进行交叉反应,计算交叉反应率.结果表明免疫抗原偶联率为1:22,最佳包被抗原质量浓度为0.25μg/mL,抗体效价128 000.优化后,通过间接竞争ELISA法建立标准曲线,IC50为0.26μg/mL,4种药物与抗体的交叉反应率均小于0.1%,特异性显著.     

乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶柱检测方法

为建立用于检测乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶柱检测方法,本研究采用活化酯法制备三聚氰胺酶标抗原,将三聚氰胺抗体、HRP抗体分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备相应的抗体胶作为检测层和质控层,方法检测限为200μg/L。选取牛奶、奶粉、发酵乳等乳制品进行检测,测得所检样品中三聚氰胺的检测限为1 mg/kg。该方法具有良好的特异性,除与环丙氨嗪存在一定的交叉反应外,与其他3种结构类似物和6种常用兽药没有交叉反应。该检测方法操作简便,结果判断容易,整个检测过程约15 min,可用作三聚氰胺现场快速检测的有效手段。     

孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

苄嘧磺隆人工抗原的合成与鉴定

以2-甲酸甲酯苄磺酰胺和琥珀酸酐为原料合成半抗原(hapten),经薄层层析和1H-NMR鉴定后,采用混合酸酐法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联获得免疫原(hapten-BSA)和包被原(hapten-OVA),紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为8:1和13:1,初步说明具有较好免疫原性。通过动物免疫实验获得了效价达1:32000的阳性血清,采用间接酶联免疫吸附检测(ELISA)法检测抗体的IC50和IC10值为0.5032mg/L和0.0024mg/L,表明人工抗原合成成功。     

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法 以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记的抗原与标准品（或样品）中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系。结果 以三聚氰胺为标准品建立标准曲线,得到方法的IC50为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9-35μg/L;检测样品的回收率为70.0%-127.9%,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论 本方法灵敏度高、特异性强、检测快速, 可以满足实际样品的检测需求。     

除草剂莎稗磷多克隆抗体的制备

根据莎稗磷的化学结构特征,设计合成莎稗磷半抗原,采用活化酯法与牛血清白蛋白偶联,免疫新西兰大耳白兔获得抗莎稗磷多克隆抗血清用于免疫分析试验。抗血清效价高达1∶160 000,100μg/L莎稗磷的抑制率达到了59.76%。抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,50μg/L莎稗磷的抑制率提高到92%,其它有机磷农药及结构类似化合物与抗体的交叉反应率均小于0.01%,表明了所制备莎稗磷抗体的高特异性。     

呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法.方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原.免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD),并检测抗体的特异性.胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性.结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD 0.07 μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应.制备的胶体金试纸条灵敏度5 μg/L.结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条.     

4种邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成及免疫检测

以4-硝基邻苯二甲酸为原料,衍生合成4 种结构类似物,并分别通过重氮化法和活泼酯法与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联制得人工抗原。利用紫外光谱扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE）检测鉴定人工抗原,并用4 种与BSA偶联的人工抗原作免疫原免疫新西兰大白兔。利用酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA）检测抗体灵敏度和特异性。经紫外光谱和SDS-PAGE证实人工抗原偶联成功,经免疫分析法检测抗体效价,4-氨基邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA,DBAP-BSA）抗体效价达到1∶64 000,4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA,DBCP-BSA）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA,DiBAP-BSA）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA,DCHAP-BSA）抗体效价均达到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分别对邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate,DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate,DCHP）4 种抗体的IC50值为0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之间交叉反应率低,反应特异性较好。     

基于单克隆抗体的三聚氰胺ELISA检测方法的建立

建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法.三聚氰胺(melamine)-BSA免疫BALB/c小鼠,通过融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,制备分泌MEL单克隆抗体(monoclonal antibody)的细胞株;体内诱生腹水制备MEL-mAb.用高碘酸钠法制备MEL-OVA-HRP偶联物并对其活性进行鉴定.分别用M...     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

目的制备高度特异的三聚氰胺单克隆抗体,经酶联免疫吸附试验鉴定并制备胶体金试剂盒。方法以牛血清白蛋白交联的三聚氰胺为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗三聚氰胺单克隆抗体,经纯化制备腹水,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immune sorbent assay, ELISA)对抗体进行效价测定、亚类测定、交叉鉴定和蛋白质免疫印迹试验(westernblot)特异性鉴定后制备胶体金试剂盒。结果筛选出1株抗三聚氰胺单抗,制备的三聚氰胺胶体金试剂盒敏感值能达到30μg/L。结论获得了高度特异的且能稳定分泌三聚氰胺抗体的细胞株。     

高效液相色谱法测定乳与乳制品中的三聚氰胺

目的建立乳与乳制品中三聚氰胺的测定方法。方法样品用0.1 mol/L的盐酸提取,再用60 g/L的磺基水杨酸沉淀蛋白。缓冲液为10 mmol/L柠檬酸与10 mmol/L辛烷磺酸钠混合溶液,以缓冲液 乙腈(85 15,体积比)为流动相,使用Kromasil KR100-5C8柱,配备有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪在200~400 nm范围内对待测组分进行分离和测定。结果样品中三聚氰胺的添加回收率在80%~105%之间,相对标准偏差(RSD,n=6)小于5.24%,方法的定量限为1.0 mg/kg。结论该方法快速、准确,操作简便,能够满足乳与乳制品中三聚氰胺的分析要求。     

酶联免疫吸附法快速测定不同样品 基质中三聚氰胺

目的 探求不同样品基质中三聚氰胺残留量的快速检测方法.为快速筛查不同种类食品中非法添加三聚氰胺提供技术保障.方法 采用酶联免疫吸附法在奶制品(奶粉、液态奶)、成品饲料(鸡饲料、猪饲料)、饲料原料(鱼粉、肉骨粉、豆粕、麸皮)、肉类(鸡肉、猪肉、内脏)等样品基质中添加一定浓度的三聚氰胺进行测定,并对检测结果进行分析.结果 酶联免疫试剂盒对奶制品和肉类检出限均能达到1.0 mg/kg;对成品饲料基质中的三聚氰胺的检测,检出限可达到2 mg/kg,而对饲料原料中的三聚氰胺的检测,检出限都不能达到2 mg/kg.结论 对奶制品中的三聚氰胺检测完全符合我国的临时限量标准;对成品饲料中的三聚氰胺残留的检测同样符合其限量标准(2.5 mg/kg),而对饲料原料中的三聚氰胺的检测,由于不同基质中检出限不同,不能直接采用酶联免疫法进行快速筛查;酶联免疫法也适用于肉类中的三聚氰胺的检测.     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

海产品贝毒素大田软海绵酸ELISA及HPLC-MS/MS检测方法的研究

为了检测海产品贝毒大田软海绵酸,保障其食用安全,利用活泼酯法将小分子OA与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术建立分泌抗OA的杂交瘤细胞株,并对其各种特性进行分析;小鼠腹水法大量生产抗体,纯化后建立ELISA方法,同时建立OA的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)检测法,并对部分市售海产品进行了实际检测,ELISA方法标准曲线为y=－34.212x+83.49,相关系数为0.9784,线性范围0.4～25μg/L,灵敏度0.18μg/L;HPLC-MS/MS检测方法标准曲线y=193.07x－780.6(Q1/Q3：m/z 827.4～m/z 723.5)和y=83.021x－335.6(Q1/Q3：m/z 827.4～m/z 809.5),R2 均为0.9991,线性范围10～800μg/L,灵敏度小于2μg/L,平均RSD为4.34%。在检测的实际样品中两种样品ELISA呈阳性反应,其中一种经过了HPLC-MS/MS的验证。所建立的ELISA及HPLC-MS检测方法均可用于海产品腹泻性贝毒OA限量标准检测,为进出口海产品OA标准方法的建立提供实验基础。     

苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制与鉴定

以羧基化的琼脂糖凝胶4FF为载体,采用碳化二亚胺法偶联抗苏丹红Ⅰ(SudanⅠ)单克隆抗体,制备苏丹红Ⅰ免疫亲和柱(IAC)。将SudanⅠ样品过免疫亲和柱,乙腈洗脱后以高效液相色谱法(HPLC)检测,紫外检测波长为478nm,流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮(体积比为21.25:3.75:60:15)。抗SudanⅠ单克隆抗体免疫亲和柱以0.3g带羧基的琼脂糖凝胶4FF与1mg SudanⅠ单抗偶联,柱容量为1.6μg。辣椒粉以0.25～3mg/kg水平添加SudanⅠ标准品,平均回收率为44.52%～77.40%,相对标准偏差为4.6%～8.3%。信噪比(RSN)为3:1时的最低检测限为15ng/mL。本实验成功制备出苏丹红免疫亲和柱。     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

RAC-OVA抗原和抗RAC单克隆抗体的筛选

在进行酶联免疫反应实验操作过程中,为了保证材料质量及使用的延续性,在使用前分别对两对抗原抗体进行了筛选和评价.主要是从抗体灵敏度的测定、抗体特异性的测定和抗体效价的测定这三个方面采选择灵敏度好、特异性强和效价高的一对抗原抗体.其中抗体灵敏度的测定中,单位1(江南大学)的抗体IC50的平均值为3.22 μg/L,灵敏度较...