人多聚免疫球蛋白受体转基因鼠的建立

目的构建携带有多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的转基因鼠,使其能以近乎自然的状态感染EBV,观察EBV在鼻咽部病变过程中的作用。方法采用角质上皮特异性启动子ED-L2调控的pIgR基因,用显微注射方法将其导入受精卵中,使该基因能在F0代转基因鼠鼻咽部特异性表达。结果PCR检测F0代pIgR基因阳性率达37.5%(6/16),Southern杂交F0代pIgR基因阳性率为12.5%(2/16)。结论表达多聚免疫球蛋白受体的转基因动物有望成为研究EBV病毒致病机制的一种新的动物模型。     

CRISPR/Cas9介导的小鼠BRCA1/BRCA2/CDH1基因乳腺特异性修饰研究

目的应用CRISPR/Cas9系统构建BRCA1、BRCA2和CDH1三基因乳腺特异性修饰小鼠模型。方法针对小鼠BRCA1、BRCA2和CDH1基因分别设计并合成sgRNA,构建p X330-sp Cas9-U6-gRNA共表达载体,将共表达载体中CBh启动子替换为乳腺组织特异性启动子WAP。利用小鼠受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠。结果共注射受精卵190枚,得到活性受精卵130枚,移植4只受体鼠。产下F0代仔鼠42只,鉴定出11只转基因阳性小鼠,阳性率为26.19%。F0代阳性鼠繁育后得到39只F1代仔鼠,其中9只为F1代转基因阳性鼠。结论通过构建乳腺组织特异表达Cas9载体成功制备了转基因阳性鼠。     

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定

目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。     

鼻咽癌组织Fas和FasL的表达及其意义

目的　探讨鼻咽癌组织Fas和FasL表达水平的变化及其意义。方法　用免疫组织化学方法检测 30例鼻咽癌患者活检的鼻咽癌组织和 1 0例正常人鼻咽部活检组织的Fas和FasL的表达。结果　鼻咽癌患者癌组织Fas表达的阳性率显著低于正常人鼻咽部黏膜组织 (P <0 0 5 ) ;EBV VCA IgA阳性患者的鼻咽癌组织Fas表达阳性率明显低于EBV VCA IgA阴性患者 (P<0 0 5 ) ;鼻咽癌患者癌组织FasL表达阳性率明显高于正常人鼻咽部黏膜上皮细胞 (P <0 0 1 ) ;Ⅲ、Ⅳ期患者NPC组织FasL表达阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者 (P <0 0 5 )。结论　鼻咽癌患者活检的鼻咽癌组织Fas表达下调而FasL表达上调 ,这可能与鼻咽癌细胞免疫逃逸有关     

EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

转染人pIgR的小鼠鼻咽上皮细胞在EBV感染前后基因表达谱差异

目的 应用cDNA阵列技术研究转染人多聚免疫球蛋白受体(hpIgR)的二亚硝基哌嗪(n，n′-dinitrosoperazine，DNP)转化的小鼠鼻咽上皮(TMNE)细胞系在：EBV感染前后基因表达谱差异，探索EBV在鼻咽癌发病过程中的作用及鼻咽癌的发病机制。方法提取转染hpIgR的TMNE细胞在EBV感染前后的总：RNA，逆转录成α-^32p-dATP标记的cDNA探针，与Atlas^TM mouse cancer array 1．2阵列膜进行杂交。利用AtlaslmageTM软件分析基因表达差异。结果 共有25个基因表达水平发生了改变．有23个基因表达上调，2个基因表达下调。结论 EBV感染可使转染细胞的多个基因表达发生改变，这些基因可能与鼻咽癌的发生、发展有关。     

转人组织蛋白酶K基因小鼠的Southern杂交鉴定

目的用地高辛标记探针的方法进行Southern杂交，以检测转人组织蛋白酶K基因小鼠外源DNA的整合情况，筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用地高辛标记探针的方法，对转人组织蛋白酶K基因小鼠(FD代)及首建阳性鼠与野生型ICR小鼠交配产生的F1代进行Southern杂交，对F0代和F1代进行筛选。结果经显微注射法，共获得25只转基因小鼠，通过Southern杂交鉴定，1只为阳性，阳性率为4％；对PCR阳性的F1代小鼠35只进行Southern杂交，结果全部为阳性。结论外源基因(人Cathepsin K基因)已整合到小鼠的染色体上，并且能够遗传。     

鼻咽部非角化性癌中TGF-β1表达与未成熟树突状细胞数量的关系及意义

目的探讨鼻咽部非角化性癌中TGF-β1表达情况和CD1a标记的未成熟树突状细胞数量及它们与病理、临床资料的联系。方法鼻咽癌组织62例、癌旁组织16例及鼻咽黏膜慢性炎症组织10例,应用免疫组化ElivisionTM法检测TGF-β1和CD1a蛋白的表达情况,并结合病理、临床资料进行统计分析。结果62例鼻咽癌组织及癌旁组织中TGF-β1阳性率分别为67．7％（42／62）、93．8％（15／16）,均高于对照组的50％（5／10）;鼻咽癌组CD1a阳性率为41．9％（26／62）,癌旁组组织阳性率为12．5％（2／16）,对照组为阴性;TGF-β1表达与CD1a呈负相关（r=-0．304,P=0．016）;TGF-β1的表达与临床分期、颈部淋巴结转移明显有关（P〈0．05）;CD1a的表达与颈部淋巴结转移之间有关（P=0．011）。结论TGF-β1可抑制imDC的增生,两者在鼻咽部非角化癌演进过程中可能起协同作用。     

小鼠补体受体Ⅱ型基因改造后感染EB病毒

通过对小鼠补体受体Ⅱ型基因 (CR2 )进行定点突变 ,然后将野生型和突变型小鼠CR2 / 1(MCR2 / 1)及人CR2 (hCR2 )用电穿孔方法导入小鼠SP2 / 0进行表达 ,采用免疫组织化学等方法鉴定阳性细胞系。用EB病毒对转染阳性细胞进行感染 ,EBER 1杂交结果显示 ,仅转染hCR2和突变型MCR2 (mtMCR2 )的SP2 / 0细胞感染了EB病毒 ,前者感染EB病毒的阳性率较后者高很多。这为进一步研究EB病毒进入细胞的机制及建立EB病毒相关的鼻咽癌动物模型奠定了良好的基础。     

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型,为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具．方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选,再通过Southern杂交进一步确证;利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化．结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射,然后植入30只假孕母鼠的输卵管中,其中26只母鼠怀孕,移植成功率为86．67％;共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因,转基因阳性小鼠比例为5．03％（9／179）,Southem杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠;随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症,鼻咽黏膜上皮灶性增生．结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠,且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生,可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段．     

EB病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达

目的:分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达.方法:EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只,尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位.结果:4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达,表达部位在细胞浆中和细胞膜上.结论:表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型.     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

小鼠补体受体Ⅱ型基因改造后感染EB病毒

通过对小鼠补体受体Ⅱ型基因（CR2）进行定点突变,然后将野生型和突变型小鼠CR2/1（MCR2/1）及人CR2（hCR2)用电穿孔方法导入小鼠SP2/0进行表达,采用免疫组织化学等方法鉴定阳性细胞系。用EB病毒对转染阳性细胞进行感染,EBER-1杂交结果显示,仅转染hCR2和突变型MCR2（mtMCR2)的SP2/0细胞感染了EB病毒,前者感染EB病毒的阳性率较后者高很多。这为进一步研究EB病毒进入细胞的机制及建立EB病毒相关的鼻咽癌动物模型奠定了良好的基础。     

EB病毒对体外培养的人鼻咽上皮细胞感染途经的研究

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记EB病毒(EBV)感染体外培养的人胚鼻咽上皮和鼻咽癌细胞株(CNE-1和CNE-2),对照为EBV受体阳性的Raji和Ramos细胞。在荧光显微镜下发现FITC-EBV 可与Raji和Ramos细胞结合,如事先经未标记的EBV处理则与 FITC-EBV 结合的阳性细胞数明显下降。贴壁生长的鼻咽上皮细胞不能与FITC-EBV 结合,而刮落的鼻咽上皮细胞则能与FITC-EBV 结合,结果提示鼻咽上皮细胞质膜微细损伤可能成为EBV 直接进入细胞的门户,受损的鼻咽癌细胞更易为EBV 侵入。     

EB病毒DNA在正常全鼻咽组织及鼻咽癌中的表现

作者应用原位核酸杂交技术，采用ＥＢ病毒ＢａｍＨＩ－Ｗ片段为探针，检测了湘南地区正常鼻咽粘膜、鼻咽低分化鳞癌和未分化癌，高分化和中分化鳞癌，颈淋巴结转移性低分化鳞癌，颈淋巴结其它部位转移癌及鼻咽临近区恶性肿瘤标本。ＥＢＶＤＮＡ阳性例数分别为０／１０个，２４／２６个，２／７个，６／６个，０／４个和４／２４个。同时，对上述病例进行血清ＥＢ病毒壳抗原免疫球蛋白Ａ抗体检测，低分化鳞癌和未分化癌阳性例数为２３／２６个，与ＥＢＶＤＮＡ检测结果一致，经统计学处理，两者具相关性。实验结果表明：（１）湘南地区鼻咽癌的发生中ＥＢＶ感染起非常重要作用，ＥＢ病毒与鼻咽低分化鳞癌及未分化癌关系密切。（２）血清ＥＢＶ壳抗原ＩｇＡ抗体检测可作为对鼻咽癌早期诊断的有效监测指标。（３）在颈部原发灶不明的转移癌中有ＥＢＶＤＮＡ片段的检出，对确定鼻咽癌的诊断具有一定的价值。