工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。 重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

β-1,3葡聚糖酶高产菌株的筛选及其产酶条件研究

从土壤中分离筛选出一株β-1，3葡聚糖酶活较高的菌株，编号为M014，初步鉴定为木霉。研究了碳源、氮源、培养温度与时间等因素对M014产酶的影响。实验结果表明，MOl4在含3％茯苓粉、0．5％酵母膏及一些无机盐的液体培养基中(pH6．0)，于30℃，150r／min振摇培养6d，β-1，3葡聚糖酶活最高，达到4．95U／ml。另外，还就β-1,3葡聚糖酶的酶解条件进行了研究，结果显示，β-1,3葡聚糖酶的最适反应pH为4．5,最适反应温度为60℃.粗酶液在40℃和50℃保温12h，酶活基本稳定，最适反应温度为60℃保温时，酶活迅速下降。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70%的（NH4）2SO4及DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28.7倍,酶回收率为45.2%。经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0～5.0、温度30～70℃酶活相对稳定。Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋以及Cu^2＋对该酶有抑制作用,Zn^2＋、Ca^2＋和Fe^2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70％的（NH4）2S04及DEAE--琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28．7倍,酶回收率为45．2％。经SDS--PAGE分析,该酶分子量近似54．6KD。酶最适反应pH为5．0,最适温度为50℃。在pH3．0-5．0、温度30℃-70℃之间酶活相对稳定。Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋以及Cu2＋对该酶有抑制作用,Zn2＋、Ca2和Fe2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。以上表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

从鲍鱼内脏提取β-1,3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶学性质。以昆布多糖为底物监控酶的活性。鲍鱼内脏经匀浆后,采用3倍体积0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)浸提12h。浸提液经离心后收集上清液,并采用60%饱和度的硫酸铵对上清液中的蛋白进行盐析沉淀得β-1,3-葡聚糖酶粗酶。研究表明,粗酶中β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为40℃,酶活力在40℃以下稳定;酶的最适pH为6.0,酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力,而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最强;亮肽酶素和1,10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用,而E-64对酶活力有一定的激活作用;此酶对海藻酸钠也有一定水解能力。     

基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性

为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。     

不同温度、pH值对β-葡聚糖酶活力的影响研究

采用DNS比色法测定不同温度和pH值对β-葡聚糖酶活力的影响,研究结果表明,β-葡聚糖酶最适反应温度为50℃,最适pH值为4.8。在pH2.0和pH 8.0的缓冲液中浸泡4h后,酶活分别保留了73%和64%。说明β-葡聚糖酶能够耐受较强的酸碱性环境。     

碎囊毛霉产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分离纯化及其酶学性质

基于碎囊毛霉M-28固态发酵方式,采用单因素试验对其所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行提取纯化条件优化,并开展部分酶学性质研究。结果表明:用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液在200 r/min浸提固态发酵基质30 min,所得粗酶液经饱和度80%硫酸铵盐析、24 h透析浓缩、Sephadex G-100柱层析分离后,经紫外分光光度计检测,得到2个蛋白峰,酶活力测定发现有一个峰具有酶活性,收集该酶活组分并采用聚乙二醇高度吸附浓缩,再用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度检验,纯化酶蛋白呈单一谱带,分子质量约为17.2 kD,酶比活力达到225.02 U/mg,纯度较粗酶液提高了2.48倍。酶的最适反应温度为55℃、在40~50℃时相对稳定,其最适pH值为5.5、酶活力在pH 4.5~5.5条件下相对稳定。Fe3+和Al3+对该酶具有明显抑制作用,Fe2+对其有激活作用,其他金属离子影响不大。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

为获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株,以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株,通过亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)和低能N+束诱变育种,筛选和选育得到两株突变株N-2-2和10-30s-3,发酵培养60 h,酶活力分别达到28.6 U/m L和36.1 U/m L,分别是出发菌株的2.36倍和2.98倍,与YC-9菌株相比,突变菌株菌体生长下降但发酵产酶量增加。进一步将β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大肠杆菌中成功表达,经过30℃诱导6 h后,胞内酶活力达79.2 U/m L,为出发菌株的6.5倍。     

微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质和基因工程研究进展

对微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质,基因克隆和表达等方面研究进展作了综述.     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业酿酒酵母表面的诱导展示表达研究

基于絮凝素FLO1基因片段为锚定序列,构建以诱导型GAL1启动子介导的表达载体YEP-GMPFAK,并实现以半乳糖为诱导剂,β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母表面的展示表达。酵母转化子发酵实验表明,在pH6.0、50℃培养条件下,经2%半乳糖诱导24 h,表面展示酶活达到最大值322.83 U/g细胞干重。酶学性质测定表明,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有良好的热稳定性。     

一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析

通过RT-PCR克隆、鉴定了黑曲霉中编码1种葡聚糖酶基因eglA6,所编码的重组酶蛋白命名为AneglA6。通过密码子优化提高了AneglA6在巴斯德毕赤酵母中的表达水平,对重组酶进行纯化并研究酶学性质,重组酶表观分子量约为52 ku。以大麦葡聚糖为底物时,重组酶比酶活为12 450. 6 U/mg;以CMC-Na为底物时,酶活是1 645. 7 U/mg;以酵母葡聚糖等β-1,3-葡聚糖为底物时,重组酶未表现出明显的活力。重组酶最适温度为75℃,在75℃和70℃下半衰期分别为1. 9和4. 6 h。AneglA6最适pH为4. 0,在pH 3. 0～5. 5范围内具有酶活力的50%以上。AneglA6是一种在酸性和高温条件下有较高活力和稳定性的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到1株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9.其发酵条件及酶学特性为:发酵 72h,在pH6.0、70℃条件下,酶活性为82.64u/mL.分子生物学及其生理生化鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).W-9产β-葡聚糖酶的酶学性质结果显示,其产β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,在70℃条件下保温时,酶活基本稳定.     

耐热β-1,3(4)-葡聚糖酶源真菌筛选、鉴定及产酶条件优化

利用葡聚糖作为唯一碳源的基础盐培养,在50℃培养条件下,从新乡周围土样及腐殖质中筛选到一株产β-1,3(4)-葡聚糖酶耐热真菌菌株(Paecilomycessp.FLH30)。该菌株在40～60℃能较好生长,最适生长温度45℃。产酶培养优化条件表明:在培养温度为45℃,初始培养基pH6.5,以大麦麸皮为碳源,以蛋白胨、酵母粉和玉米浆为有机氮源,发酵4d,葡聚糖酶活达132.4U/mL,葡聚糖酶最适pH和温度分别为7.0和70℃。     

扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分离和性质研究

以扇贝加工废弃物消化腺为原料,经磷酸缓冲液抽提、80%饱和度硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析等步骤,获得β-1,3葡聚糖酶.经SDS-PAGE检测,扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的相对分子质量为157kDa.β-1,3-葡聚糖酶水解木耳多糖(β-1,3-葡聚糖)的最适pH为7.0,最适温度为30℃.通过Lineweaver-Burk作图,得到其米氏常数Km为13mg/mL.     

黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

小麦麸皮内源性β-木糖苷酶酶活测定及酶学性质

以PNP-β-xylopyranoside为底物确定小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶活力测定条件,并对β-木糖苷酶的酶学性质进行研究。试验确定酶活测定条件为底物浓度1mg/mL,提取液pH 5。木糖苷酶的酶学性质:最适反应温度为60℃,在20~50℃时稳定性好,保温60min后其活力可保持在70%以上,最适pH值为5,在pH值5~6时对木糖苷酶的破坏力相对较小,保温60 min后其活力仍可保持在80%以上。动力学参数Km和Vmax分别为4.518mg/mL,0.392μmol/(min·g)。通过对4种小麦麸皮酶活力进行测定发现:细麸中的β-木糖苷酶活性均高于粗麸,粗麸中郑麦8998的木糖苷酶酶活最大,细麸中花培8号小麦木糖苷酶活性最大。