一株肠致病性大肠杆菌的全基因组序列分析

目的 分析并找出肠致病性大肠杆菌Deng(Enteropathogenic Escherichia coli Deng,EPEC Deng)的全基因组序列特点.方法 EPEC Deng来源于我国婴幼儿腹泻患者的粪便标本,菌株采用诊断血清鉴定血清型,通过自动细菌鉴定仪,使用微量肉汤法进行药敏试验.进一步提取细菌总DNA,构建测序文库,通过Illumina 2000仪器测序,然后利用多引物PCR等方法进行补缺口及拼接,最终获得完整的全基因组.采用相关软件获得基因序列,通过对比已知的蛋白数据库进行基因功能注释及生物信息学分析.结果 EPEC Deng菌株归属O119:H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药,对其余的抗菌药物均敏感.EPEC Deng基因组包含5 233 046 bp,GC含量50.48％.基因组通过注释后总共有5 347个编码蛋白序列,80个tRNA的编码基因,以及22个完整的rRNA基因编码的操纵子.EPEC染色体基因组中含有致病岛,大小约为40Kb左右,与数据库中的一个37Kb的致病岛(AF200363.1)序列极为相似,相似度达到99％.结论 完成了肠致病性大肠杆菌基因组精细测序分析,PAI是EPEC致病的关键,为进一步研究菌株的进化关系提供了基因数据.     

引起血流感染的耐万古霉素肠球菌基因型、 毒力及MLST分型研究

目的 调查引起血流感染的耐万古霉素肠球菌 (VRE) 的检出情况,并对其进行耐药基因型、毒力和多位点序列分型 (MLST) 研究。 方法 收集2012年7月~2015年7月从笔者医院血培养阳性标本中分离的68株屎肠球菌和28株粪肠球菌,采用含6μg/ml万古霉素的脑心浸液平皿筛选VRE。采用多重PCR法检测vanA、vanB及粪、屎肠球菌种特异基因,另一种多重PCR法检测常见5种毒力基因 (esp、hyl、gelE、asa1和cylA)。采用MLST技术分析菌株序列型 (ST) 从而进行同源性分析。 结果96株肠球菌中共检出22株VRE (22/96,2.9%),包括20株屎肠球菌 (20/68,9.4%) 和2株粪肠球菌 (2/28,7.1%)。所有VRE耐药表型与基因型一致,属vanA型。20株屎肠球菌VRE仅esp (16/20,0.0%) 和hyl (10/20,0.0%) 阳性;2株粪肠球菌VRE仅gelE和 asa1阳性。20株屎肠球菌VRE分属7个ST型,包括8株ST78 (8/20,0.0%)、6株ST17 (6/20,0.0%) 以及2株ST18和ST389、ST414、ST571、ST564各1株。 结论 笔者医院VRE耐药问题严重,耐药基因和毒力基因携带率高。20株屎肠球菌VRE经eBURST软件分析均属于与医院感染相关的CC17克隆复合群。     

粪肠球菌对利奈唑胺低水平耐药机制的研究及同源性分析

目的研究4株临床分离的利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌的耐药机制及同源性。方法收集临床分离的利奈唑胺耐药粪肠球菌4株,采用微量肉汤稀释法确认菌株对利奈唑胺最低抑菌浓度（MIC）;PCR扩增和测序检测23SrRNAV区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因（rplC、rplD）及多重耐药基因cfr和新型耐药基因optrA。多位点序列分型（MLST）分析菌株同源性。结果4株粪肠球菌对利奈唑胺MIC值均为8滋g/ml,均为低水平耐药,23SrRNAV区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因均未发现任何位点突变,未检测到cfr基因,但均携带optrA基因。MLST分型显示4种ST型,分别为ST476、ST16、ST116、ST75。结论初步推断携带optrA基因与粪肠球菌对利奈唑胺呈现低水平耐药有关,耐药菌株在本院呈散发。     

1例肺炎患者利奈唑胺耐药粪肠球菌定植规律研究

目的研究1例肺部感染患者体内利奈唑胺耐药粪肠球菌株突变以及定植特点。方法从1例反复发作肺炎(1年内反复发作5次)的急性白血病患者的气管分泌物中分离出10株粪肠球菌株,菌株的MIC值通过E-test测定,经PCR扩增细菌4个拷贝23S r RNA基因V区基因,测序分析突变位点,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)观察分离菌株同源性。结果患者5次肺炎发作从气管分泌物中分离的10株粪肠球菌株均为利奈唑胺不敏感株(4株为中介耐药株,6株为耐药株),通过PCR和测序发现4株利奈唑胺中介耐药株含有1个拷贝23S r RNA基因V区G2424U突变,而利奈唑胺耐药菌株同时含有G2424U和G2576U双突变。通过PFGE分型检测提示10株粪肠球菌株具有同源性。通过肉汤稀释法鉴定这些菌株均对万古霉素敏感。结论利奈唑胺耐药粪肠球菌株可能长期定植于患者体内,并导致反复感染。     

肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮耐药性关系研究

目的探究肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮类药物耐药性的关系。方法全部试验菌株使用VITEK 2-Compact仪器和GPI卡进行鉴定。通过PCR和单链构象多态性(SSCP)法检测对左氧氟沙星(Levo)与环丙沙星(Cip)耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌GyrA基因有无碱基发生突变,并通过基因测序确定其突变类型。检测了30株粪肠球菌在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/mL利血平后Cip MIC值的改变。结果 PCR-SSCP分析结果表明40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌均扩增出GyrA基因,其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC 29212和敏感菌株的单链泳动带相比较出现异常。其中粪肠球菌在第87位上有密码子改变:GAA变为GGA;屎肠球菌在第83位有密码子改变:AGT变为TAT,这些突变均可引起氨基酸的改变。在M-H琼脂中加入利血平可以提高部分粪肠球菌对环丙沙星的敏感性。结论用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的GyrA基因并通过测序分析,显示有70%(28株)肠球菌碱基发生了突变,说明GyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因,此外还有药物泵出等耐药机制的存在。     

利奈唑胺诱导粪肠球菌耐药50S核糖体蛋白突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体蛋白位点变异特征。方法收集1株血流感染的粪肠球菌利奈唑胺敏感株,通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增核糖体蛋白L3和L4(对应rpl C和rpl D基因),扩增产物经测序后与野生株比较,获得核糖体蛋白及对应氨基酸的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株。PCR测序分析2株母株均无变异位点,rpl C基因对应的氨基酸位点不尽相同,rpl D基因普遍存在T301C位点变异,对应的氨基酸为Phe101Leu。结论体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与核糖体蛋白位点突变密切相关,但仍需进一步研究证实突变位点与耐药的关系。     

粪肠球菌和屎肠球菌临床分离株的毒力因子与耐药性分析

目的 检测临床分离肠球菌的耐药和毒力因子,比较粪肠球菌和屎肠球菌的耐药性和毒力特征.方法 采用琼脂稀释法检测肠球菌对万古霉素(VAN)、四环素(TET)、环丙沙星(CIP)、红霉素(ERY)、复方新诺明(SMZ)、替考拉宁(TEC)、克林霉素(CLI)的耐药性;采用微量板测定肠球菌的生物膜形成能力;观察肠球菌的β溶血和明胶溶解结果,同时用PCR方法检测相应基因cylA和gelE.结果 粪肠球菌和屎肠球菌的耐药率分别为0%～100%和3.23%～96.77%,后者对环丙氟哌酸、红霉素的耐药程度高于前者.β溶血试验阳性率为19.23%,cylA基因阳性率为35.38%;明胶表型阳性率为21.54%,gelE阳性率为40.0%,其中有46.15%(12/26)阳性者未出现相应表型;生物膜形成检出率为36.92%;粪肠球菌3种毒力因子(表型和基因型)的阳性率均高于屎肠球菌.结论 屎肠球菌耐药率高于粪肠球菌,粪肠球菌毒力因子阳性率高于屎肠球菌.     

肠球菌毒力岛基因的检测

目的 探索肠球菌中毒力岛基因的存在情况.方法 使用PCR和杂交方法对155株肠球菌进行毒力岛相关基因检测.结果 155株肠球菌中,88.39%携带至少一个毒力岛基因,各基因阳性率由高至低依次为hyd(81.94%),psaA(78.06%)、nuc(57.42%)、esp(53.55%)、cylB(52.90%)和gls24-lik e(38.06%);除esp基因,其他5个基冈的阳性率均是粪肠球菌高于屎肠球菌,其中nuc、cylB、gls24-like三个基冈的阳性率有统计学差异.粪肠球菌中临床分离株各基因的阳性率和所携带的基冈数均高于健康人分离株.结论 肠球菌普遍携带毒力岛相关基因,粪肠球菌各基因阳性率高于屎肠球菌,粪肠球菌中临床分离株所携带的毒力基因、毒力岛基因数目均明显高于健康人分离株.     

A preliminary study on the bacteria strain genes with NDM-1 in Ningxia

目的 掌握宁夏携带I型新德里金属β-内酰胺酶(blaNDM-1)细菌的流行现状.方法 用聚合酶链反应(PCR)检测以腹泻病分离保存的菌株,对blaNDM-1检测为阳性的菌株进行生化鉴定、药物敏感性试验,检测blaNDM-1基因测序和16SrRNA序列.结果 2株blaNDM-1基因阳性的菌株均为屎肠球菌,是多重耐药株;blaNDM-1测序结果与国外基因序列比对,同源性为100%.结论 宁夏存在携带blaNDM-1基因的革兰氏阳性屎肠球菌.     

利奈唑胺体外诱导粪肠球菌中介耐药及机制研究

目的 研究利奈唑胺对粪肠球菌中介耐药的体外诱导作用并探讨其耐药机制.方法 采用多步诱导法对4株临床分离粪肠球菌以及质控菌株进行体外诱导耐药试验,采用琼脂平皿二倍稀释法测定诱导前后的MIC值,采用PCR测序法检测粪肠球菌4个23S rRNA V区基因的变异.结果 4株临床分离粪肠球菌和质控菌株均诱导出中介株和稳定耐药株,在中介株和耐药株中均检测到了G2576U、G2505A和C2424U变异,2株中介株和耐药株还同时存在G2576U和C2424U变异.结论 利奈唑胺可体外诱导粪肠球菌产生中介株和稳定性耐药株,粪肠球菌中介株即可出现23S rRNA V区基因变异.     

广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区（NCR）长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02,GZ/218/2002）,1995年广东分离株（GD23/95,GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型;而1999年广东分离株（GD05/99）,1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：71/     

185株粪肠球菌与屎肠球菌的临床分布及耐药性分析

目的 了解2009至2011年安徽地区粪肠球菌与屎肠球菌的临床分布及耐药情况,为临床合理用药提供参考证据.方法 185株粪肠球菌与屎肠球菌药敏试验采用琼脂稀释法,结果依据CLSI 2010年推荐的标准进行判读.结果 3年临床分离菌株共185株,其中粪肠球菌92株,屎肠球菌93株,主要分离于尿液及分泌物,其中粪肠球菌分别占63.4%和11.8%,屎肠球菌分别占48.9%和16.3%;粪肠球菌对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星的敏感性高于屎肠球菌,屎肠球菌对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的敏感性高均达90%以上,粪肠球菌对三者的敏感性均在90%左右,然而无论粪肠球菌和屎肠球菌对红霉素的耐药性均很高,分别为76.3%和92.6%.结论 粪肠球菌与屎肠球菌对不同的抗菌药物的敏感性不同,临床上应加强对粪肠球菌和屎肠球菌的监测及抗菌药物使用的管理,预防和减少耐药菌株的产生.     

次氯酸钠溶液冲洗根管对粪肠球菌的作用研究

[目的]研究次氯酸钠溶液对根管内粪肠球菌的作用效果。[方法]将20个离体前磨牙的感染根管标本随机均分为两组，5．25％次氯酸钠溶液冲洗组（NaClO0）和0．9％生理盐水冲洗组（NaCl）。在根管预备、冲洗后取样培养，分别检测24、48h、1周时粪肠球菌的菌落数目。[结果]24、48h，5．25％NaClO组粪肠球菌完全被杀灭，菌落计数为0CFUmL^-1，NaCl组均数分别为1．2×10^6CFUmL^-1、1．7×10^6CFUmL^-1；1周时，5．25％NaClO组有极少量的粪肠球菌被检出，菌落计数为109CFUmL^-1，而NaCl组均数为3．8×10^6CFUmL^-1，两组于3个时间点的差异均具有显著性意义（P〈0．01）。[结论]5．25％次氯酸钠溶液冲洗根管能立即抑制粪肠球菌，但不能完全清除粪肠球菌。     

肠球菌耐药性与耐万古霉素基因初步检测

目的了解肠球菌对六种常用抗生素的耐药情况,同时检测耐万古霉素肠球菌（VRE）的耐万古霉素基因型。方法用K-B纸片琼脂扩散法检测肠球菌对万古霉素、替考拉宁、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星以及庆大霉素等六种常用抗生素的敏感性。采用含6μg/mL万古霉素的琼脂稀释筛选平板法（ADSP）筛选VRE菌株,并用多重聚合酶链反应（multiplex-PCR）检测VRE的耐万古霉素基因型。结果 100株临床分离肠球菌中以粪肠球菌（86%）和屎肠球菌（11%）为主。除万古霉素和替考拉宁外,屎肠球菌对其它几种抗生素的耐药率明显高于粪肠球菌（P〈0.05）;庆大霉素高耐株检出率为54%,其对常用抗生素的耐药率明显高于低耐株（P〈0.05）。用ADSP法筛选出3株（3%）耐万古霉素肠球菌,其中只有一株铅黄肠球菌为耐万古霉素基因型阳性（VanC2）,其余两株均为Van基因阴性。结论 ADSP法用于筛选VRE较K-B法检出率高;本次研究只分离出一株VanC2型VRE,没有发现具有重要临床意义的VanA和VanB型VRE;肠球菌对庆大霉素（120μg/片）的耐药率为54%,建议临床慎用;万古霉素、替考拉宁、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦均可作为治疗粪肠球菌感染的药物,但需密切注意肠球菌耐药情况。     

我院腹腔感染需氧及兼性厌氧病原菌及药物敏感性分析

目的研究我院2011年1月-2012年5月腹腔感染患者需氧及兼性厌氧病原菌分布及其体外抗菌药物敏感性。方法采用VITEK COMPACT全自动微生物鉴定及药敏分析仪进行菌种鉴定,药物敏感性检测采用微量稀释法,采用WHONET5.5进行结果分析。结果共分离病原菌111株,其中革兰阴性杆菌78株（70.3%）,革兰阳性菌33株（29.7%）。分离率名列前7位的分别是大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌复合群、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌。对肠杆菌科菌敏感性〉90%的抗菌药物有亚胺培南（100%）,厄他培南（100%）,阿米卡星（97.7%）,哌拉西林/他唑巴坦（90.7%）,头孢替坦（90.7%）;鲍曼不动杆菌耐药率高,多重耐药株和泛耐药株的比例分别高达90%和60%;铜绿假单胞菌中多重耐药株检出率为14.3%;万古霉素、利奈唑胺和替加环素对所有屎肠球菌和粪肠球菌均敏感（敏感菌均为100%）;屎肠球菌整体较粪肠球菌耐药率高;未发现耐万古霉素金黄色葡萄球菌。结论我院腹腔感染的病原菌以革兰阴性菌特别是肠杆菌科菌为主,鲍曼不动杆菌是重要的院内腹腔感染菌且耐药率高,屎肠球菌是最常见腹腔感染革兰阳性致病菌。细菌耐药形势严峻,应采取积极有效的措施控制耐药菌的增多与传播。     

男性不育患者精液病原菌分离及其药敏分析

目的了解本地区男性不育患者生殖道感染细菌的分布特点和耐药情况,为临床治疗提供参考。方法对2009年8月～2010年7月我院生殖健康科送检的2 316份男性不育患者精液标本进行细菌培养,并以法国梅里埃的全自动细菌鉴定药敏系统（VITEK-2 compact）对分离出的纯菌株进行鉴定和药敏试验。结果 2 316份标本中229份分离出细菌229株,均为每例单一菌株,总检出率为9.89%,其中G~＋菌141株,占61.6%,G~-菌85株,占37.1%,真菌3株,占1.3%。排名前三位的病原菌分别是大肠埃希菌（21.4%）、无乳链球菌（17.5%）、粪肠球菌（13.5%）;大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的有10株（20%）,无乳链球菌和粪肠球菌对红霉素和四环素耐药率较高（〉50%）。结论男性不育患者精液细菌感染的菌种分布以革兰阳性球菌为主,治疗用抗生素应根据药敏试验结果合理选用,是减少耐药菌株产生的必要手段。     

2009-2011年住院患者临床分离肠球菌耐药性分析

目的：分析2009-2011年我院临床分离肠球菌的耐药特点及流行分布,为合理治疗肠球菌感染提供依据。方法：收集我院住院及门诊患者连续分离的、不重复的肠球菌92株,以2010CLSI纸片扩散法为判断标准,对分离菌进行耐药性分析。结果：3年来从各种临床标本中共分离到粪肠球菌52株,屎肠球菌23株。标本主要来源于尿液（41%）和腹腔引流液（24%）。屎肠球菌对青霉素类、氟喹诺酮类、大环内酯类和高水平庆大霉素的耐药性均高于粪肠球菌;未检出耐万古霉素和利奈唑胺的肠球菌。结论：屎肠球菌的耐药性高于粪肠球菌,应加强对屎肠球菌的耐药监测,防止多重耐药菌的发生和传播。     

2009-2011年我院感染主要细菌的分布及耐药监测

目的了解近3年医院感染的主要细菌分布及其对抗菌药物敏感性情况。方法对本院2009年1月-2011年12月住院患者的15 868例标本进行细菌培养,分离出的细菌用美国德灵公司Microscan-walkaway 96全自动细菌鉴定仪进行鉴定和药敏分析。结果共分离出细菌142类,1 783株,其中G-菌1 443株（80.93%）,G＋菌340株（19.07%）。常见菌种分布依次为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍氏/溶血不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌。1 783株细菌在各类标本中的分布以痰液最多,其次是尿液、血液、咽拭子、脑脊液、脓液等;常见菌种对多种抗菌药物的敏感性较低,各种肠杆菌属细菌对亚胺培南最为敏感,G＋菌对万古霉素最为敏感。结论近3年医院感染的细菌仍以G-菌为主,并主要存在于下呼吸道,且耐药严重。     

黄柏与五倍子抗菌活性物对肠球菌抑菌效果

目的探讨高速逆流色谱(HSCCC)法提纯黄柏与五倍子配伍抗菌活性物质对粪肠球菌体外抑茵效果的影响。方法选择150株临床分离野生粪肠球菌株,随机分为Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅲ组,每组各50株,均配制成2000cfu/ml~3000cfu/ml的菌液。黄柏与五倍子配伍药做成中药煎剂,配制成浓度成1g/ml为A药液,高速逆流色谱法提纯黄柏与五倍子配伍抗菌活性物质,配制成浓度成1g/ml为B药液;Ⅰ组将粪肠球菌液涂到用A药液与M-H培养基混合的培养基上,Ⅱ组将粪肠球菌液涂到用B药液与M-H培养基混合的药液培养基上,Ⅲ组将粪肠球菌液涂到M-H培养基上,上述培养基均贴上环丙沙星(CIP)、红霉素(ERY)、四环素(TE)、青霉素(PEN)、氯林可霉素(ClE)、苯唑青霉素(OXA)和克拉霉素(CLA)药敏纸,并观察培养基药敏情况。结果Ⅰ组的CIP、ERY、TE、PEN、ClE、OXA和CLA耐药率分别为26%、40%、36%、30%、42%、38%和24%,Ⅱ组Ⅲ组为10%、26%、14%、8%、18%、24%、4%,和76%、92%、100%、88%、96%、90%、60%,对CIP、ERY、TE、PEN、ClE、OXA和CLA耐药率ⅢⅠ组Ⅱ组,三组之间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论高速逆流色谱法提纯黄柏与五倍子配伍抗菌活性物质对临床分离的粪肠球菌菌株具有较强的抑菌活性,其抑茵作用比黄柏与五倍子配伍药做成中药煎剂强。