抗CD40单克隆抗体诱导树突状细胞增殖和分化成熟作用研究

探讨ＣＤ４０分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养共获得了树突状细胞，经流式细胞仪表型分析，活细胞计数，混合淋巴细胞反应等方法测定抗人ＣＤ４０单抗体ＣＤ４０分子的激发作用。结论抗人ＣＤ４０激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。     

CD69在人外周血活化的γδT细胞表面的表达

目的:观察CD69在人外周血γδT细胞表面的表达及与γδT细胞活化的关系.方法:抗CD3单克隆抗体及结核杆菌低分子多肽刺激人外周血单个核细胞(PBMC)及纯化的T细胞,流式细胞仪检测不同时相γδT细胞表面CD69分子的表达率.结果:抗CD3单抗、Mtb抗原刺激PBMC后3h,γδT细胞表面即表达CD69,24h达高峰;单独抗CD3或Mtb抗原刺激纯化的T细胞,CD69分子表达升高不明显,加入激发型抗CD28单抗作为第二信号,CD69表达率明显升高.结论:CD69分子在活化的γδT细胞表面高表达,可作为γδT细胞完全活化的一个指标.     

4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞活化的影响

目的:探讨4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞活化及共刺激分子表达的影响。方法:用CD3单抗刺激SLE患者外周血单个核细胞,并用抗4-1BBL单抗阻断4-1BBL/4-1BB共刺激信号,流式细胞术检测阻断前后T、B细胞上4-1BB、CD40L、4-1BBL、CD40以及CD69表达水平。结果:SLE患者T细胞上CD69表达明显高于正常对照组(P<0.01);SLE患者外周血T细胞上4-1BB、CD40L和B细胞上4-1BBL、CD40表达明显高于正常对照组(P<0.01),活化后T细胞上共刺激分子表达升高更加明显(P<0.01);抗4-1BBL单抗阻断后4-1BB、CD40L表达明显下降(P<0.01),B细胞上CD40表达下降,与SLE未活化组和活化组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SLE患者外周血T、B细胞活化水平升高,4-1BBL/4-1BB信号对其活化状态维持可以起重要作用。     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。     

CD28、CD40通路共刺激对淋巴细胞增殖反应的影响及CsA的抑制作用

目的：探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞增殖反应的变化及免疫抑制剂环孢素A(CsA)、抗CTLA4单克隆抗体对共刺激通路激活后淋巴细胞增殖反应的影响。方法：采用单克隆抗体与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40L分子结合产生相应刺激信号,根据刺激条件不同设组为：①抗CD3单抗单刺激(A组)(剂量为10μg／L、100μg／L、1000μg,／L);②抗CD3单抗 抗CD28单抗(B组);③抗CD3单抗 抗CD40L单抗(C组);④抗CD3单抗 抗CTLA4单抗(D组)共刺激(A、B、C、D组中抗CD3单抗剂量固定为100μg／L,其余3种单抗各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L3种剂量);⑤抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗(E组);⑥抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CTLA4单抗(F组)共刺激(E、F组中抗CD3单抗和抗CD28单抗的剂量固定为100μg／L,抗CD40L单抗和抗CTLA4单抗的剂量各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L);⑦CsA干预组：抗CD3单抗 CsA(G组);⑧抗CD3单抗 抗CD28单抗 CsA(H组);⑨抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗 CsA(I组),G、H、I组中所有单抗浓度均固定为100μg／L,CsA浓度设为10μg／L、100μg／L、1000μg／L。采用[^3H]-TdR同位素掺人法测定淋巴细胞增殖水平,液体闪烁计数仪测定放射性计数值。结果：用抗CD3单抗 抗CD28单抗共刺激后,淋巴细胞增殖反应明显高于抗CD3单刺激,而在抗CD3单抗 抗CD40L单抗刺激组,淋巴细胞增殖反应低于抗CD3单刺激组。抗CTLA4单抗所提供的刺激信号可抑制抗CD3单刺激及抗CD3 抗CD28共刺激导致的淋巴细胞增殖反应,并且随着抗CTLA4单抗剂量的增加,抑制作用增强。CsA对共刺激后的淋巴细胞增殖反应有抑制作用,且随着剂量增大其抑制作用也增强,但对单刺激后增殖反应的抑制作用更为明显。结论：CD28共刺激通路在淋巴细胞活化中起着关键作用。抗CD40L单抗的刺激作用可能被其对T细胞与抗原递呈细胞(APC,包括B细胞等)间的阻断效应所掩盖。抗CTLA4单抗及CsA对共刺激后淋巴细胞的增殖反应均有抑制作用。     

热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用

目的：研究热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用。 方法：采用GM-CSF和IL-4将人外周血单核细胞诱导成未成熟树突状细胞,然后用热休克蛋白融合蛋白刺激其分化成熟,以单核细胞条件培养液（MCM）和模拟的单核细胞条件培养液（MCM mimic）为对照。以流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达情况。 结果：热休克蛋白融合蛋白可以刺激树突状细胞表面表达CD40、CD80、CD86和HLA-A2分子。结论：热休克蛋白融合蛋白可诱导人树突状细胞分化成熟。     

CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性抗人ＣＤ４０单克隆抗体、转导ＣＤ３２的Ｌ细胞（ＬＣＤ３２）和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖、生长和分化的ＣＤ４０系统。方法：①流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达;②在ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１）与ＬＣＤ３２共培养中,加入ＩＬ－４及其它细胞因子,组成ＣＤ４０培养系统,观察人扁桃体来源Ｂ细胞的体外生存和增殖等生物学效应。结果：①ＣＤ４０分子表达于人外周血、扁桃体来源的Ｂ细胞及人多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞株ＸＧ２和人Ｂ淋巴瘤细胞株Ｄａｕｄｉ;②用ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１和２Ｇ１１）与ＬＣＤ３２细胞联合ＩＬ－４能使静止期Ｂ细胞体外长期生存和增殖。表明用激发型ＣＤ４０单抗５Ｃ１１和２Ｇ１１建立的ＣＤ４０培养体系,能使Ｂ细胞长期生存和增殖,为体外研究Ｂ细胞提供了有效的手段。     

CD40、CD40L和sCD40在B细胞恶性血液肿瘤中的作用

CD40、CD40L和sCD40作为重要的信号分子,在诱导抗原呈递细胞、T细胞的活化与肿瘤免疫中发挥着重要作用.该文探讨这三种分子在急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等疾病中的发病机制,以及多种CD40结合药物,如CD40L三聚体（CD40LT）、CD40单抗和CD40L阳性细胞目前作为免疫治疗药物在血液肿瘤治疗中的临床意义.     

乳腺癌患者外周血中树突状细胞表面标记CD1a、CD83的研究

目的：对乳腺癌患者外周血中培养的树突状细胞（dendritic cells,DC)表面分子CD1a,CD83的表达进行研究。方法：采用密度梯度离心的方法分离人外周血中的单个核细胞，用粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF），白细胞介素-4（IL-4），肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子组合，刺激DC增殖，分化，用标有荧光素的单抗标记培养细胞，在流式细胞仪上分析所培养的细胞。结果：该细胞表达CD1a,CD83分子，但CD1a,CD83在CD3^ T,CD19^ B淋巴细胞上也表达，CD1a,CD83在活化的淋巴细胞上表达水平比未活化的高，CD19^ B细胞上表达水平比CD3^ T细胞高。结论：CD1a,CD83等分子并非DC特有的标记，目前鉴定DC仍然要靠细胞形态，细胞表达CD1a,CD83以及共刺激分子等综合因素来确定DC。     

CD40、CD40L在人单核细胞和在动脉粥样硬化斑块中共同表达的意义

目的：探讨CD40、CD40L在人单核细胞和在动脉粥样硬化斑块中共同表达的意义。方法：CD40及CD40L在单核2细胞表面的表达分别采用荧光技术，RT－PCR，流式细胞信和Western blotting检测。人的动脉粥样硬化斑块中CD40及CD40L的表达采用免疫组织化学方法。结果：人单核细胞能连续表达CD40及CD40L，并且细胞因子IL－1，IL－6，TNF和TNF－γ能明显上调单核细胞表达CD40、CD40L的水平。人动脉粥样硬化斑块中能共同表达CD40及CD40L，而动脉壁的其它部分不表达。结论：人单核细胞表面及粥样硬化斑块中能共同高表达CD40及CD40L，提示CD40及CD40L相互作用在动脉粥样硬化形成及其发展中起重要作用。     

激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡及其机制探讨

目的 探讨激发型CD40单克隆抗体对人B淋巴细胞恶性肿瘤的生物学效应及其机制。方法 将激发型CD40单克隆抗体5C11加入肿瘤细胞的体外培养体系，采用细胞计数，流式细胞仪等方法分析单克隆抗体5C11对不同肿瘤细胞株的作用。结果 5C11能引起CD40表达的多发性骨髓瘤（MM）细胞株XG2和恶性淋巴瘤细胞株Daudi发生同型聚集，抑制其生长并介导凋亡；CD40分子介导的XG2和Daudi细胞凋亡作用与可溶性TNF产生无关。结论 激发型CD40单克隆抗体通过诱导B细胞恶性肿瘤细胞的凋亡。抑制肿瘤细胞的体外生长。     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

系统性红斑狼疮患者外周血OX40和OX40L分子的表达

目的探讨OX40和OX40L分子在系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T淋巴细胞和单核细胞上的表达及其在SLE发病机制中的可能作用。方法采用流式细胞术检测26例SLE患者和15例健康志愿者外周血T细胞上OX40和单核细胞上OX40L的表达水平。结果 SLE患者外周血CD4＋T细胞OX40表达水平为8.91±5.07,显著高于正常对照组（3.46±1.72）（P〈0.05）,而CD8＋T细胞OX40表达水平为3.89±1.94,与对照组（3.34±1.44）的差异无统计学意义（P〉0.05）;外周血单核细胞上OX40L表达水平（31.23±10.05）显著高于正常对照组（21.01±6.92）（P〈0.05）。结论 SLE患者外周血T细胞和单核细胞上存在OX40和OX40L的异常表达,提示OX40/OX40L信号在T细胞与单核细胞相互作用过程中可能有助于T细胞的持续活化,从而参与SLE的发生发展。     

OX40/OX40L与疾病

OX40/OX40L是机体免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子,参与T细胞的活化、增殖和迁移,以及生发中心的形成和树突状细胞的分化成熟。在介导肿瘤免疫应答和自身免疫疾病的发生、发展中具有重要作用。OX40只表达于活化的T细胞表面,且主要是CD4+T细胞。OX40+T细胞是抗原特异性T细胞,集中于淋巴组织的T细胞区和外周的炎性位点,非炎性相关组织及外周血中很少出现,有很强的区域特异性。OX40L能协同刺激T细胞的活化,促进B细胞产生高效价抗体和类别转化,介导OX40+T细胞向炎症部位浸润。     

人树突状细胞体外提呈凋亡胆管癌细胞抗原的研究

目的：建立从人外周血诱导扩增树突状细胞（ＤＣ）及其从恨癌细胞提呈抗原的方法。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞,加入５０ｎｇ／ｍｌ ｈＧＭ－ＣＳＦ,１０００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ－４,隔天１次共４次,培养第３天,加入γ射线照射过和胆管癌细胞,再继续体外培养１周后,用树－突状细胞富集柱收集ＤＣ。结果：ＤＣ高表达共刺激分子Ｂ７和ＣＤ１ａ,表面具有典型不规则突起,ＤＣ捕捉凋亡小体、吞噬凋亡小体,负载抗原的     

p40同源二聚体对Th17细胞增殖及IL-17分泌的影响

目的研究p40同源二聚体（p40）：对银屑病患者外周血辅助性T细胞亚群17（Thl7）功能的影响。方法取C57BL／6小鼠骨髓,体外培养诱导分化Th0和Thl7细胞,采用流式细胞术检测（p40）：对细胞增殖和细胞内自介素17（IL-17）分泌的影响。提取正常人和银屑病患者外周血单个核细胞（PBMC）,酶联免疫吸附ELISA法检测和分析（p40）：对细胞培养上清中IL-17释放的影响。结果流式细胞仪检测结果显示：加入（p40）：对Th0细胞增殖无明显影响,而对Thl7细胞增殖分裂有显著促进作用;与未加入（p40）：的Thl7细胞比较,加入（p40）：的Thl7细胞能分泌更多的IL-17。与未加入（p40）。的银屑病患者外周血PBMC比较,加入（p40）：的银屑病患者外周血PBMC培养上清中的IL-17含量显著增高（P〈0．01）,加入与未加入（p40）：的正常人PBMC培养上清中的IL-17含量比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论细胞因子（p40）,在银屑病发病中具有重作用,揭示了p40单抗治疗银屑病有效的可能机制。     

人B淋巴母细胞系体外培养方法的优化及其影响因素

目的探讨体外建立健康人外周血B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的优化方法及其影响因素。方法用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞（PBMC）,加入CD40激发型抗体（5C11）、CpGDNA免疫调节基因序列以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A（CysA）抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察B-LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析B-LCLs膜表面分子CD19的表达水平。结果PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B-LCLs。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体（5C11）及CpG免疫调节基因序列联合EBV感染人PBMC,明显地提高了转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。结论CD40信号激发和CpG免疫调节基因序列联合运用能有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。     

细胞因子对人单核/巨噬细胞表达CD40和CD40L的影响

目的：探讨细胞因子在γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）和白介素-1（IL-1）对人单核/巨噬细胞表达CD40和CD40L的影响。方法：应用RT-PCR方法半定量测定CD40和CD40LmRNA含量,流式细胞技术检测细胞表面CD40和CD40L表达水平。结果：IFN-γ,TNF和IL-1既增加CD40和CD40LmRNA表达,又能诱导单核/巨噬细胞表面CD40和CD40L高表达,而抗氧化剂VitE能下调细胞因子引起的CD40和CD40L表达,但作用不完全,结论：细胞因子（IFN-γ,TNF和IL-1）能刺激单核/巨噬细胞高表达CD40和CD40L,这种作用可被VitE部分抑制。     

The expression of CD40 and CD40L on the surface of peripheral blood mononuclear cells in asthmatic rats and the effect of anti-CD40L McAb on Th1 and Th2 cytokines

Objective： To investigate the expression of CD40 and CD40 ligand （CD4OL） on the surface of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs） in asthmatic rats and the effect of anti-CD40L McAb on cytokines of PBMCs. Methods： Flow cytometry and RT-PCR were used to detect the expression of CD40 and CD40L of PBMCs in asthmatic rats. After the PBMCs was treated with anti-CD40L McAb, ELISA was used to detect the IL-4 and IFN-γ levels of culture supernatants. Results： Compared with the normal control group, the expression of CD40 and CD40L of PBMCs in asthmatic rats increased （P 〈 0.05）. Compared with the untreated group, the level of IL-γ and the ratio of IL-4/IFN-γ decreased after the PBMCs was treated with anti-CD40L McAb（P 〈 0.05）. Conclusion： The expression of CD40 and CD40L on the surface of PBMCs in asthmatic rats was up-regulated. Anti-CD40L McAb can rectify the imbalance of Th1 and Th2 cytokines.