快速提取肉类基因组DNA的裂解液的研究

目的配制一种快速提取肉类DNA且满足重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)要求的裂解液。方法分别配制3种裂解液:Na OH裂解液、Chelex裂解液与PBS裂解液,取200μL裂解液与20 mg肉类样品进行混合,振荡5 s,取上清液稀释10倍直接作为扩增模板。结果 3种裂解液中Na OH裂解液提取DNA在稀释与未稀释条件下均有较好的扩增,Chelex裂解液提取DNA在稀释与未稀释下均无扩增,PBS裂解液提取DNA在稀释作用下有较好的扩增,在未稀释作用下无扩增。裂解液提取法和试剂盒方法提取的纯度、产物的大小几乎一致,所扩增的为同一产物,裂解液所需成本与试剂盒方法相比较低。结论 Na OH裂解液可以在5 min内提取肉类中的DNA,浓度与纯度均较高,所需时间短,成本低,且满足分子检测要求。     

生鲜牛乳总微生物基因组DNA的提取

目的 建立高效快速提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA的方法。方法 以生鲜牛乳为原料, 采用SDS-蛋白酶K法裂解细胞, 酚氯仿有机抽提去除蛋白和醋酸钾溶液沉淀蛋白, 制备样品中总微生物基因组DNA。结果 以NET(Tris?HCl, EDTA, NaCl)作为裂解缓冲液, 蛋白酶K消化得到的基因组DNA纯度和产量较高, 耗时较短; 缓冲液选择NCT(NaCl, CaCl2, Tris?HCl)时, PCR产物特异性低于前者且产量较低。RNA酶消化对产品纯度影响不大且会降低产量。用醋酸钾(KAc)沉淀去除蛋白, 操作快速简单, 耗时最短, 但DNA产量最低。结论 SDS-蛋白酶K法提取的生鲜乳微生物总DNA可以作为牛乳样品进一步检测的分子基础。     

一种适用于乳制品基因组DNA快速提取方法的研究

目的对比NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种方法提取乳制品中核酸的提取效果,优化提取条件,确定一种更适用于现场检测、简便快速的的乳制品DNA快速提取技术。方法以牛奶、水牛奶、牦牛奶、羊奶、骆驼奶、以及驴奶6种常见的乳制品为材料,分别用NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种提取方法提取乳制品中的DNA,并根据裂解液用量和裂解时间进行优化,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,检测DNA提取的质量和灵敏度。结果 NaOH裂解法能够提取所有物种的乳制品DNA,而且可以在最佳裂解条件下提取模拟掺假混合乳的DNA进行检测,发现其检测限能达到1%的牛奶含量。结论该方法取样量小,成本低,在15 min内即可完成快速提取,为实验室乳制品DNA定性或定量鉴别,以及乳制品的现场掺假鉴别提供了一种快速灵敏低成本的样品前处理技术。     

五种DNA提取方法对酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比较

针对酸奶及菌粉样品,比较多种样品前处理条件,包括取样量、菌粉溶剂及溶菌酶孵育时间等,最大程度去除样品中的脂肪、蛋白质及多糖,比较五种DNA提取试剂盒对益生菌DNA的提取效果。提取的DNA经Nano Vue Plus测定浓度和纯度,PCR扩增综合评价提取效果。结果显示,酸奶取样量为100 mg时DNA浓度为49.00 ng/μL,A_(260)/A_(280)比值为1.8;采用纯牛奶溶解菌粉更为彻底,0.5 g/m L牛奶溶解菌粉后,提取DNA浓度可达到81.00 ng/μL;溶菌酶最佳孵育时间为1 h,增加孵育时间对细菌裂解没有明显帮助。同时,采用五种试剂盒所提取的DNA浓度均在20 ng/μL以上,A_(260)/A_(280)比值大于1.8或接近1.8,其中,Tiangen试剂盒提取的DNA浓度和纯度综合评价优于其他4种试剂盒。结果表明,实验建立的前处理方法能够有效的去除酸奶及菌粉中的脂肪、蛋白质及多糖,提高DNA提取的浓度及纯度;采用的五种商品化试剂盒均能用于酸奶和菌粉中益生菌DNA快速提取,在步骤、得率及纯度上各有差异,应按照不同的实验要求进行选择。     

烤后烟叶基因组DNA提取条件优化

为解决烤后烟叶基因组DNA提取稳定性差的问题,以烤后烟叶为材料,对CTAB法提取基因组DNA进一步改良优化:对CTAB沉淀缓冲液使用量、裂解时间、Tris平衡酚的处理次数和RNase处理时间4个影响因素进行单因素优化.实验结果表明:CTAB沉淀缓冲液使用DNA溶液体积的1.5倍、裂解时间40 min、Tris平衡酚抽提1次和RNase(10 mg/mL,1μL)处理10 min,能得到主带清晰的烤后烟叶基因组DNA.该方法提取得到的烤后烟叶基因组DNA OD260/OD280为1.7～1.9,OD260/OD230>2.0,35 ng左右基因组DNA即能得到清晰的RAPD和SCAR图谱,适用于以PCR为基础的分子生物学实验.     

动物组织DNA提取前处理方法的优化研究

为优选拍击式均质法提取动物组织DNA的影响因素,开发一种简便快速的动物组织DNA提取前处理方法。研究采用L25(56)正交设计试验,以猪肉组织为对象,对拍击式均质法提取DNA前处理过程中不同的稀释倍数、拍击时间、拍击次数、取样量和消解时间进行工艺优化,按照优化后的前处理方法对8种生鲜肉或加工肉进行DNA提取,并进行定量PCR扩增验证。结果表明:当稀释倍数为1:2和1:3(g/g)、拍击时间为1 min、拍击次数为10次/s、取样量为100 mg,消解时间为1.5 h时,拍击式均质法提取的猪肉组织DNA质量最好,采用最佳优化条件对8种生鲜肉或加工肉提取的DNA与液氮研磨法提取的DNA定量PCR扩增,2种前处理方法提取DNA结果扩增曲线和Ct值均无差异,所开发的拍击式均质法提取动物组织DNA科学可行。     

大体积肉中DNA提取方法的优化

目的优化一种从大体积肉类中提取DNA的方法。方法从大组织肉上多点取样,用组织粉碎机打碎,称取10 g肉加入90 m L PBS缓冲液和450μL蛋白酶K,60℃消化至澄清后,混匀,取200μL消化液用试剂盒进行DNA提取;再与常规试剂盒方法提取的DNA在同条件进行实时荧光PCR及琼脂糖凝胶电泳验证。结果 2种方法提取DNA的Ct值差异在0.5个循环以内,无显著性差异(P0.05);电泳结果显示,2种方法所扩增的为同一产物。结论该方法取样具有代表性,可适用于大体积肉类掺假检测或动物源性成分检测中的DNA提取。     

农田土壤中病原真菌DNA提取方法的研究

通过比较不同的研磨、洗涤、裂解和沉淀方法,成功获得一种适于土壤真菌DNA提取的方法.结果表明,采用石英砂研磨、TENP和PBS联合洗涤、SDS高盐裂解、异丙醇沉淀等一系列步骤,所获取的土壤微生物DNA质量最佳.该试验方法可以直接从土壤中提取微生物基因组,尤其适用于土壤病原真菌的提取,所得DNA完全可以直接用于酶切和PCR扩增.该方法高效、价廉、操作简单,对改进土壤病原菌生态的研究方法具有重要价值.     

野油菜黄单胞菌基因组DNA快速提取方法和酶切

本文建立了一种野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)基因组DNA的简便快速提取方法。用去污剂SDS和CTAB破坏细胞膜结构,使胞内核酸释放,用酚/氯仿/异戊醇去除蛋白质,经异丙醇沉淀DNA,TE溶解DNA。采用此SDS和CTAB结合的方法提取的DNA琼脂糖电泳图谱与试剂盒UNIQ-10提取的基因组DNA及D-5010A试剂盒法提取的基因组DNA图谱相同,DNA经紫外分光光度计检测OD260/OD280在1.80～1.90之间。DNA能被EcoRI、XbalI酶切消化。本方法能快速简便地提取野油菜黄单胞菌DNA,提取的DNA含量较高、纯度较好,比试剂盒更经济,也可用于酶切分析、构建文库和PCR扩增。     

水果果肉中总DNA提取方法的比较研究

为了获得高效通用的水果果肉DNA提取方法,本研究以11种水果为试验材料,从前处理方法、裂解液成分、异丙醇沉淀时间等方面对CTAB法进行了改进,并比较了行业标准法、试剂盒法、改良CTAB法3种方法的提取效果,发现改良CTAB法提取的水果果肉DNA浓度都在46.25μg/m L以上,纯度都在1.8左右,且能扩增出137 bp的18Sr DNA条带,从而确定了高效通用的水果果肉DNA提取方法:改良CTAB法。     

一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法

油料作物种子中,大量油脂、蛋白、酚类物质的存在和易氧化的特点导致RNA提取困难。为了解决这一问题,本研究在商业化RNA提取试剂盒的基础上,通过以下3方面的改进,使之成功应用于油菜、花生、芝麻和大豆的各个时期种子RNA提取和后期的荧光定量分析实验：1）增加抗氧化剂巯基乙醇和PVP;2）根据不同作物的油脂含量调整氯仿的比例;3）改进RNA沉淀方法,加大洗脱液体积后用乙醇沉淀。与常规的CTAB、TRIZOL及文献报道的RNA提取方法比较,本方法提取的RNA更完整、得率更高、纯度更高;所得RNA被成功应用于FAD2基因的荧光定量表达分析,发现了四种作物种子不同发育时期的FAD2基因的表达差异,证明了改良方法的有效性。     

浓香型白酒酒醅中总RNA提取方法评价

为探寻我国特有的复杂微生态环境——浓香型酒醅样品总RNA提取方法,本实验建立了一种改良的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）-苯酚法,并从提取成本及耗时、RNA质量浓度和纯度、电泳结果、反转录效果及高通量测序分析5 个方面,比较其与试剂盒法、Trizol法、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法和月桂酸钠法提取酒醅样品总RNA的效果。结果表明,SDS-苯酚法和CTAB法成本较低,试剂盒法成本最高但耗时最短;试剂盒法提取的总RNA质量浓度最高,分别约为SDS-苯酚法、Trizol法、CTAB法和月桂酸钠法的1.84、2.33、19.14 倍和3.09 倍;SDS-苯酚法和试剂盒法提取样品总RNA的OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm均分别大于1.8和2.0;SDS-苯酚法电泳条带完整性优于其他方法,CTAB法无法检测到电泳条带。SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法所提取的RNA能有效反转录为cDNA并将其用于高通量测序分析,3 种方法所得优势微生物种属（Lactobacillus和Clostridium）及不同发酵节点酒醅之间的微生物群丰度变化情况基本一致,其中SDS-苯酚法获得的微生物群落多样性最高,且能较好地反映不同酒醅间微生物类群的差异;Trizol法和试剂盒法均能偏好性地多获得1 个属,但其含量均很低（0.01%）。本研究系统地比较了5 种常见的总RNA提取方法在浓香型酒醅RNA提取的应用效果,其中本研究建立的改良SDS-苯酚法具有一定的综合优势,为今后以RNA为基础的酒醅分子生物学研究提供理论依据,同时对其他富含糖、腐殖质及酚类等杂质的环境样品RNA提取具有较好的借鉴意义。     

采用CTAB沉淀法提取茶多糖

以信阳毛尖为研究对象 ,以水为溶剂 ,在一定的条件下提取茶多糖。提取液用十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)进行沉淀 ,通过正交试验确定了CTAB沉淀法提取茶多糖的最佳工艺条件为 :离心时间 1 2min ,CTAB加入量 2 5mL ,沉淀时间 6h ,该条件下多糖得率为 1 3 4%。     

莲雾果实高质量总RNA提取方法的建立

为从莲雾果实中提取高质量RNA,以“黑珍珠”莲雾果实为材料,采用试剂盒法、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）法、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB）法、改良CTAB法和Trizol法5 种总RNA提取方法进行比较分析。结果表明,SDS法得到的总RNA质量较差,有严重的降解和DNA污染;Trizol法提取物中有较多蛋白和多糖等残留,无条带出现。CTAB法、改良CTAB法和试剂盒法均能获得质量较好的莲雾果实总RNA,经实时荧光定量聚合酶链反应验证得到条带与目的片段大小一致,表明该RNA均能满足后续分子生物学研究。     

正交试验优选蓝参降脂方水提醇沉工艺

目的优选蓝参降脂方中绞股蓝、荷叶水提醇沉工艺。方法采用正交设计法,以总皂苷含量和干膏率为指标,考察加水量、提取时间、提取次数等因素对水提工艺的影响;考察药液相对密度、醇沉浓度、醇沉时间对醇沉工艺的影响。结果最佳水提工艺条件是:加入10倍药材量的水,提取3次,每次1 h;最佳醇沉工艺条件是:控制药液相对密度为1.15~1.19,调整乙醇浓度至65%,醇沉时间24 h。结论此提取工艺稳定可行,重现性好。     

超声波提取-气相色谱法测定鱼类食品中的多氯联苯

采用超声波提取鱼肉样品,探索以下超声波条件对食品中多氯联苯提取效果的影响:溶剂用量、温度、超声功率、超声波提取时间.研究结果表明,最佳提取条件为:5g鱼肉样品用30mL正已烷提取,提取温度为35℃,超声波功率为90kHz,超声时间为120min.方法的回收率为40.7％～96.7％,平均为66.0％.当PCBs浓度在0.08μg/mL以下时,标准曲线的直线相关系数达到0.9966 (n=4).     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料,采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白,对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明,采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素,2mol／L硫脲,4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐）,65mmol二硫苏糖醇,0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7,全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白,以150μg上样,按IEF程序Ⅱ（30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,0．5h;10000V,2h;10000V,8h）进行等电聚焦,10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳,银染方法检测,可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。     

皮革中多菌灵等三种防霉剂的检测方法研究

应用固相萃取及高效液相色谱技术,建立了同时测定皮革中多菌灵、百菌清和甲基托布津含量的方法。皮革样品经乙腈超声提取后,由弗罗里硅土固相萃取小柱净化,以Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm,5μm)色谱柱为分析柱,乙酸铵水溶液一甲醇为流动相,线性梯度淋洗,紫外二极管矩阵检测器检测,波长为240或270nm。结果表明,多菌灵、百菌清和甲基托布津在0.5~15.0 mg·L-1范围内有良好的线性关系,方法的定量下限(S/N=10)分别为0.06、0.8、0.5 mg·kg-1,加标回收率为90.2%~97.7%,变异系数(CV)不大于7.9%。