PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

抑制SIRT2介导的心肌程序性坏死改善衰老心肌的缺血耐受

【立论依据】 衰老心肌对缺血/再灌注(I/R)损伤的耐受力显著降低。并且,坏死是I/R心肌死亡最主要的病理途径,但以往认为心肌坏死不可调控。最新发现SIRT2介导的RIP1去乙酰化是触发程序性坏死(Necroptosis)这一可调控性细胞坏死的关键机制。 【设计思路】 本研究以成年和老年组为对比,结合基因和药理学干预,从整体,器官,细胞,分子四个水平进行功能验证, 旨在探讨衰老状态下SIRT2介导的心肌Necroptosis是否是老年心肌缺血损伤加重的新机制。 【实验内容】 采用成/老年C57小鼠建立整体心肌I/R(30 min/4 h)模型。分别于基础状态和I/R后检测各组心肌SIRT2表达水平及其活性;RIP1的乙酰化水平。采用免疫共沉淀方法检测RIP1-RIP3复合物(necrosome)水平;免疫组化方法检测下游分子MLKL的质-膜转位;再灌注后测定心肌梗死面积。采用成年SIRT2 KO和RIP3 KO小鼠建立心肌I/R平行实验,分析SIRT2介导的促坏死在心肌缺血易损中的关键作用。进而,采用心肌点注射腺病毒或siRNA 上调/下调成年和老年心肌SIRT2的表达,在整体水平明确衰老状态下心肌SIRT2对I/R心肌Necroptosis以及心肌损伤的影响。运用离体心脏灌流结合SIRT2特异阻断剂AGK2和Necroptosis抑制剂nec-1,建立成/老年小鼠离体心脏I/R模型。在器官水平探讨干预SIRT2介导的Necroptosis能否抑制衰老心肌死亡。再则,建立体外心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,使用AGK2或nec-1处理细胞;采用细胞动缘探测系统观察单心肌细胞收缩舒张功能;流式细胞仪检测PI和Annexin V双阳性细胞定量检测心肌Necroptosis程度与细胞存活率。在细胞水平阐明干预SIRT2介导的Necroptosis促进衰老心肌存活的分子机制。 【材料】 成年(4个月龄)及老年(22个月龄)C57小鼠。 【可行性】 老年组I/R心肌SIRT2活性显著增高,RIP1乙酰化水平随之降低,necrosome水平升高,MLKL细胞质-膜转位增加(均P<0.05)。离体灌流实验发现,AGK2可有效抑制老年I/R心肌SIRT2活性,减小老年组心肌损伤。心肌细胞实验显示,抑制SIRT2介导的Necroptosis可提高H/R后心肌存活率(均P<0.05)。现有的实验结果表明本设计切实可行。 【创新性】 我们有望首次证实:SIRT2介导的Necroptosis加重是老年心肌缺血易损性增加的重要原因;针对性的抑制心肌SIRT2可显著改善衰老心肌抗I/R损伤能力。本研究将为降低老年缺血性心脏病患者的心肌损伤提出新的干预靶点。     

菩人丹对ob/ob小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响

[目的]考察菩人丹对肥胖小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响,为中药复方菩人丹调节糖脂代谢的临床应用提供实验依据。[方法]将ob/ob小鼠随机分为模型组和菩人丹组,后者给予菩人丹干预15周,以C57BL/6J为空白组。测定小鼠空腹体质量、内脏脂肪指数、空腹血糖（FPG）、空腹血清胰岛素（FINS）及血脂水平,计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）及胰岛素敏感指数（ISI）,评价胰岛素抵抗与分泌水平,口服葡萄糖耐量试验（OGTT）考察ob/ob小鼠对葡萄糖的耐受性;苏木精-伊红（HE）染色观察睾周脂肪细胞形态。[结果]模型组ob/ob小鼠的空腹体质量、内脏脂肪指数、OGTT曲线下面积、血脂水平与HOMA-IR均显著升高,ISI显著下降;菩人丹对ob/ob小鼠空腹体质量、内脏脂肪指数及糖耐量的影响无统计学意义;菩人丹能够降低ob/ob小鼠血清中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）及HOMA-IR,升高ISI,同时使ob/ob小鼠睾周脂肪细胞排列相对规则有序。[结论]经15周观测,模型组ob/ob小鼠已形成肥胖、血脂紊乱、糖耐量损伤以及胰岛素抵抗,糖尿病前期模型复制成功;菩人丹有效改善了ob/ob小鼠糖脂代谢紊乱,增强了胰岛素敏感性,降低了胰岛素抵抗程度,表明菩人丹对糖尿病前期向2型糖尿病发展有确切的干预效果。     

Exendin-4对AD样学习记忆减退的保护作用及其机制的研究

【立论依据】 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease AD)是一种慢性神经退行性疾病。异常过度磷酸化的细胞骨架蛋白Tau和神经丝(NFs)是早期病理改变,与胰岛素信号的失调存在密切关系。艾塞那肽Exendin-4是哺乳动物胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)受体的有效激活剂,能够增加葡萄糖的利用和代谢,与脑内GLP-1R结合后有神经保护作用。 【设计思路】 采用胰岛素抵抗的AD动物模型,研究艾塞那肽对AD样认知、记忆减退和神经纤维退行性变的影响;检测动物的学习记忆能力、胰岛素信号分子、NF的糖基化和磷酸化、突触素的表达水平,进一步阐明胰岛素信号和神经纤维退行性变的关系和可能的机制。 【实验内容】 (1)实验分组:本实验采用PS1/APP/Tau三转基因鼠(3×Tg-AD)和c57BL6小鼠(野生鼠),每种小鼠分4组:①、②组高糖高脂饲料饲养8周,腹腔注射STZ一次建立Ⅱ型糖尿病模型;③、④组腹腔注射生理盐水。①、③组皮下注射Exendin-4,给药治疗8周,②、④组不给药,等量注射生理盐水8周。(2)Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力。(3) 处死小鼠,迅速取脑,左半脑置于10%中性甲醛固定,病理切片用于免疫组织化学荧光。右半脑组织裂解匀浆,蛋白质印迹技术检测小鼠脑组织相关蛋白的改变。 ELISA检测各组小鼠脑内Aβ40和42的沉积。 【材料】 动物:PS1/APP/Tau三转基因鼠(3×Tg-AD)、c57BL6小鼠(野生鼠);试剂:链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、艾塞那肽(Exendin-4 ) 【可行性】 本团队前期Exendin-4对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的保护性实验,提示Exendin-4的保护作用,给我们后期动物实验打下的基础。 【创新性】 (1)本设计采用的Tau/APP/PS1三转基因小鼠,建立同时具有NFT和SP两种病理改变和学习记忆障碍的动物模型,能更好的模拟临床AD的发病过程和病理特征。(2)本设计建立胰岛素抵抗的AD模型,有利于阐明了胰岛素信号转导途径的失调在 AD的发病的重要作用。(3)本项目所要阐明的实验现象和机制,还没有相关的研究报告,有很好的创新性和前沿性。     

移植转导自身免疫调节因子的骨髓细胞对I型糖尿病预防和治疗的实验研究

【立论依据】 I型糖尿病又称自身免疫性糖尿病,是由于自身免疫耐受机制打破、自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞所致的自身免疫性疾病。迄今对自身免疫病的治疗方案多不理想,目前常规采用的免疫抑制手段不但降低患者免疫力,也使疾病容易复发。理想的治疗自身免疫病的策略是特异性清除自身反应性T细胞,重建对自身组织抗原的免疫耐受。而自身免疫调节因子(AIRE)恰在胸腺阴性选择中具有调控组织限制性抗原(TRAs)表达、促进自身反应T细胞的清除、参与免疫耐受诱导的功能。因此,我们设想利用基因转导手段操纵骨髓细胞中AIRE的表达,通过模拟胸腺的阴性选择,诱导免疫耐受,为I型糖尿病的防治提供新策略。 【设计思路】 本实验拟通过以自身免疫糖尿病小鼠(NOD鼠)为模型,移植表达AIRE的骨髓细胞,使其在NOD鼠体内通过调控TRAs的表达清除自身反应性T细胞,观察其诱导特异性清除对胰腺组织特异性T细胞的作用及对NOD鼠糖尿病发生的影响,探索I型糖尿病防治新方法。 【实验内容】 (1)构建编码小鼠AIRE的逆转录病毒载体,将其转导入骨髓DCs细胞。(2)将转导AIRE的骨髓DCs细胞移植至经放射线照射的NOD小鼠,获得NOD嵌合鼠。(3)采用流式细胞术检测NOD嵌合鼠胸腺和脾脏中GFP⁺细胞数量,检测NOD鼠嵌合程度。(4)采用real-time PCR法、流式细胞术检测Ins2 mRNA水平和蛋白水平表达变化,检测AIRE对TRAs的调控作用。(5)检测NOD鼠糖尿病发生时间和程度以及其病理学和胰岛素自身抗体的改变。 【材料】 NOD鼠、编码AIRE的逆转录病毒载体、real-time PCR仪、流式细胞仪、葡萄糖检测试剂盒、尿糖试纸、ELISA试剂盒等。 【可行性】 前期工作中,以胸腺阴性选择为理论依据,对AIRE的表达、分布及其在自身耐受中的作用进行了系统、深入的研究,现以基因转导和骨髓细胞移植为技术手段,切实可行。 【创新性】 本研究首次将基因操纵和骨髓细胞移植两大先进技术相结合,利用AIRE能特异性清除自身反应性T细胞的功能,探究治疗I型糖尿病的方法,为自身免疫疾病的防治提供新思路。     

氯化钆对胰岛素原剪切的影响

【立论依据】 胰岛素是维持机体糖代谢平衡的最重要的激素。在胰岛β细胞中,胰岛素原需要经过激素原转化酶(PC3和PC2)的剪切才能生成真正具有降低血糖作用的胰岛素。因此,激素原转化酶对胰岛素的成熟具有决定作用。众多研究表明,糖尿病患者和动物胰岛中激素原转化酶的含量显著不足。而我们的前期实验提示,稀土化合物氯化钆(GdCl3)能够增加激素原转化酶的表达量,从而促进胰岛素原的剪切成熟。 【设计思路】 糖尿病小鼠经氯化钆治疗后,检测小鼠血清中胰岛素与胰岛素原的含量,以及胰岛中激素原转化酶的表达量。 【实验内容】 以高脂喂养的C57BL/6J糖尿病小鼠作为研究对象,随机分为两组,分别腹腔注射氯化钆(治疗组)和生理盐水(对照组)。注射4周后,抽取治疗组和对照组小鼠的血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰岛素原和胰岛素的含量,进而分析胰岛素的剪切成熟情况。同时,分离提纯两组小鼠的胰岛,通过实时定量PCR和Western方法检测胰岛中激素原转化酶(PC3和PC2)表达量的变化。 【材料】 C57BL/6J小鼠,高脂饲料,胰岛素原ELISA试剂盒,胰岛素ELISA试剂盒,PC3和PC2的引物及抗体。 【可行性】 该实验所需要的多项实验技术,如糖尿病小鼠模型的建立、小鼠胰岛的分离纯化、胰岛素及胰岛素原的检测等方法,均已成熟。设计实施该实验的团队,已经具备了一定的生理学、生物化学、分子生物学和细胞学等基础知识,并且参与过多项动物及分子生物学实验,在实验的基础操作方面已十分熟练,具备参加科研的基础知识和动手能力。同时,团队成员做事踏实认真,并能独立查阅国内外文献,具有较强的解决问题、设计实验的能力。此外,该团队的指导教师长期从事糖尿病治疗的相关研究,能够对该课题的实施进行必要的指导。 【创新性】 氯化钆对糖尿病的治疗作用鲜有报道,且作用机制尚未阐明。氯化钆对胰岛素的作用效果及机制尚无任何报道,本实验属首次。     

激活腺苷酸活化蛋白激酶改善离体小鼠心脏缺血再灌注后心肌胰岛素抵抗

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对离体小鼠心脏缺血/再灌注(I/R)后心肌胰岛素抵抗的影响及机制。方法 AMPK基因敲除(AMPKα2-/-)和C57BL/6小鼠各18只,均各随机分为对照(Control)组、I/R组、AICAR(AMPK激活剂)处理(ARCAR+I/R)组。建立Langendorff离体小鼠心脏灌注模型,检测灌注前后灌注液中葡萄糖浓度;灌注结束后,检测灌注液中肌酸激酶(CK)及肌钙蛋白I(c Tn I)浓度;实验结束后,用TTC染色法检测心肌梗死面积;胱天蛋白酶-3活性检测法检测心肌细胞凋亡。结果与Control组相比,I/R组心肌葡萄糖摄取量下降,但是在C57BL/6小鼠,预给予AMPK的激活剂AICAR,可以改善I/R后心肌对葡萄糖的摄取。在AMPKα2-/-小鼠,给予AMPK的激活剂AICAR并不能改善I/R引起的心肌葡萄糖摄取下降。进一步研究发现,在C57BL/6小鼠中,与I/R组相比,给予AMPK的激活剂AICAR能明显降低I/R心脏的心肌损伤,表现为血清中CK及c Tn I含量降低(P 0.05)、心肌梗死面积减小(P 0.05)及心肌细胞凋亡减少(P 0.05)。但是,在AMPKα2-/-小鼠中,AICAR处理并不能有效地改善I/R后心肌的损伤(P0.05)。通过采用心率压力指数进一步衡量I/R后心脏功能,结果发现,在C57BL/6小鼠,给予AICAR促进I/R后心脏收缩舒张功能恢复,但上述保护作用在AMPKα2-/-小鼠消失。结论心脏I/R会引起心肌胰岛素抵抗,引起心肌损伤,但是通过激活AMPK可以部分改善I/R引起的心肌胰岛素抵抗,进而发挥心肌保护作用。     

肝脏脂肪变对胰高血糖素受体的表达影响

目的 观察胰高血糖素受体（GCGR）在ob/ob小鼠肝组织以及肝癌细胞株HepG₂细胞脂肪变后表达变化。方法 分别检测10周龄的雄性ob/ob小鼠和同窝野生对照小鼠的体重、肝功、血糖、血脂以及胰岛素等指标,用荧光定量PCR方法、Western blot法和免疫组化分别检测两组鼠肝脏中gcgr基因、蛋白表达的差异以及定位情况。不同浓度油酸处理HepG₂细胞,油红O染色观察HepG₂细胞脂肪病变程度,QPCR法和Western blot法检测细胞gcgr mRNA和蛋白的表达变化。结果 GCGR广泛表达于多种组织,以肝脏表达较多,ob/ob小鼠呈现明显的脂肪肝性病变,且免疫组化结果发现,ob/ob小鼠与正常对照小鼠相比,肝脏中GCGR表达减少;mRNA表达水平分别为0.709±0.174 vs 1.000±0.000,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;蛋白表达水平分别为0.761±0.211 vs 1.200±0.346,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。不同浓度梯度油酸处理HepG₂细胞,其GCGR mRNA和蛋白水平表达随油酸浓度增加而逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 肝脏脂肪性病变降低了肝脏GCGR表达水平,从而可能影响肝脏的糖脂代谢。     

左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响

【立论依据】 观察左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病(DN)小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白及Rho、ROCK蛋白表达的影响研究左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响。 【设计思路】 MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。观察左归降糖益肾方对DN小鼠血糖、肾功能及Rho、ROCK蛋白表达等的影响研究其是否具有保护DN肾脏的作用及是否通过抑制Rho／ROCK信号通路改善足细胞损伤。 【实验内容】 8周龄MKR小鼠50只随机分为5组,空白组(A组)、DN组(B组)、DN＋左归降糖益肾方组(C组)、DN＋Rho/ROCK信号通路抑制剂Y-27632组(D组)、DN＋糖适平＋贝那普利组(E组)。B、C、D、E组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术后2周开始给药。C组小鼠给予中药提取液灌胃治疗30 d。D组小鼠给予Y-27632腹腔注射15 d(隔天注射)。E组给予糖适平＋贝那普利灌胃治疗30 d。A、B组则以等体积蒸馏水灌胃。30 d后处死小鼠。电化学法检测小鼠空腹血糖,全自动生化仪检测尿素氮、血肌酐,ELISA法测定尿微量白蛋白,免疫组化及蛋白质印迹法测定肾脏组织Rho、ROCK蛋白表达,光镜观察肾小球形态结构,电镜观观察足细胞形态结构。 【材料】 MKR小鼠、左归降糖益肾方、贝那普利、糖适平、Y-27632、高脂饲料等。 【可行性】 课题组前期研究表明高脂饮食联合右侧肾切除的MKR转基因2型糖尿病小鼠是良好的糖尿病肾病模型;左归降糖益肾方具有改善糖尿病肾病的作用。国内外研究中均表明抑制Rho／ROCK信号通路具有保护糖尿病肾脏的作用。故本实验基于Rho／ROCK信号通路研究左归降糖益肾方对糖尿病肾病的作用机制具有可行性。 【创新性】 (1)MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。(2)近年来研究发现Rho／ROCK信号通路在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用。本实验基于Rho／ROCK信号通路探讨左归降糖益肾方对糖尿病肾病足细胞损伤的影响。     

齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用

目的 观察齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法 建立链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病小鼠模型,ig 给予齐墩果酸3周。实验期间监测小鼠体质量、血糖的变化,实验结束后检测小鼠血清胰岛素浓度以及血清和胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 的活性以及丙二醛 (MDA) 的量。通过胰腺 HE 染色和胰岛素免疫组化分析胰岛的病理变化,应用 Western blotting 法检测胰腺组织中 NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表达量的变化。结果 齐墩果酸能增加糖尿病小鼠的体质量,降低糖尿病小鼠的空腹血糖,升高血清中的胰岛素浓度,显著提高血清和胰腺中 SOD 和 CAT 的活性,MDA 水平显著降低。HE 染色等形态学检测显示齐墩果酸能减轻小鼠胰岛萎缩,增加胰岛β细胞的数目。Western blotting 结果显示齐墩果酸增加胰腺组织内 IκBα 的表达,降低 NF-κB p65 蛋白表达。结论 齐墩果酸能减轻 STZ 诱导的胰岛损伤,可能是通过减轻氧化应激水平,减弱胰岛内 NF-κB 信号通路的过度激活而发挥保护作用。     

MiR-182模拟物提高1型糖尿病小鼠的心脏功能

目的 探讨miR-182模拟物对1型糖尿病小鼠心脏功能的影响及可能作用机制。方法 40只8周龄雄性C57小鼠随机分为正常对照组（n=5）,miR-182模拟物对照组（n=5）,1型糖尿病组（n=15）,1型糖尿病+miR-182模拟物治疗组（n=15）。腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立1型糖尿病动物模型。实验于8周末结束,采用小动物用高分辨超声仪测量小鼠心脏功能;运用透射电镜观察心肌组织超微结构改变;利用real-time PCR技术检测心肌组织β-肌球蛋白重链（β-MHC）,α-肌球蛋白重链（α-MHC）,心房钠尿肽（ANP）,Ⅰ型（Col Ⅰ）和Ⅲ型胶原（Col Ⅲ） mRNA及miR-182 mRNA的表达含量。结果 ①miR-182模拟物可改善1型糖尿病小鼠的心脏功能,增加心脏射血分数及左室短轴缩短率（P<0.01）;②miR-182模拟物可降低糖尿病小鼠心肌组织ANP、Col I、Col Ⅲ的表达及β/a-MHC比值（P<0.01）;③miR182模拟物可改善1型糖尿病小鼠心肌超微结构变化,减轻自噬。结论 MiR-182模拟物能改善1型糖尿病小鼠的心脏功能,其机制可能与减轻心肌肥大和心肌纤维化,减轻线粒体结构损伤及减轻自噬有关。     

虎杖苷在小鼠冠状动脉缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

【立论依据】 心脏冠状动脉阻塞,再灌注疗法,极易造成大量自由基产生、钙超载和心肌细胞凋亡等损害。减少心肌细胞再灌注后凋亡仍是治疗冠心病的首要任务。研究表明虎杖苷在缺血再灌注损伤中有增加NO含量,减少自由基损害、提高心功能的保护作用,但其具体机制不明。 RhoA/ROCK通路的激活是缺血再灌注损伤中参与细胞凋亡的机制之一。新近研究表明,生理状态下,血管紧张素受体Ⅱ2型(AT2R)可通过激活RhoA-Pser188抑制ROCK下游通路,达到保护细胞正常生理状态的作用。因此,我们提出,病理状态下,AT2R对ROCK通路的影响是什么?虎杖苷对心肌缺血再灌注(I/R)是否通过该通路起到保护作用?因此,该项目的研究为虎杖苷改善冠脉血流、提高心功能提供实验依据和理论基础。 【设计思路】 实验分为正常对照组,I/R组,单纯虎杖组和虎杖治疗组。通过观察不同时间节点:术后1 h、24 h和7 d,通过心动超声及各种生化检测,研究缺血再灌注机制,并在此基础之上,研究虎杖对缺血再灌注的保护机制。 【实验内容】 (1) 建立小鼠缺血再灌注(I/R)模型。(2) TTC和evans blue染色,并检测凋亡。(3) 留取血清检测cTnT。(4) 留取蛋白检测ROCK激酶活性、RhoA-Pser188、AT2R。(5) 检测血清和组织中NOS、iNOS 活性及 NO 含量。 【材料】 C57小鼠24只,小动物超声仪,小动物心电图测量仪和各种生化检测仪器。 【可行性】 深圳大学机能平台具备所有小动物心功能检测和生化指标检测仪器。 【创新性】 本项目首次提出虎杖苷通过AT2R磷酸化RhoA-Pser188位点,从而抑制ROCK-心肌细胞凋亡通路,深入阐明虎杖苷保护缺血再灌注损伤机制。本项目首次在整体动物模型基础上,研究中药单体虎杖苷对心脏缺血-再灌注的治疗作用,摸索治疗的最佳浓度和作用的时间窗,具有很好的新药开发和临床应用前景。其次,本项目围绕虎杖苷改善冠脉血流,从分子、细胞、组织及整体水平等多个层次对其作用机制展开深入的研究,有较大的基础理论价值。     

GDF11对II型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用

目的 观察GDF11对Ⅱ型糖尿病C57BL/6J小鼠心肌损伤的保护作用及心肌凋亡水平的变化情况。方法 60只体重20~25 g的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为3个组：正常对照组（control）、Ⅱ型糖尿病模型组（DM）和GDF11干预组（DM+GDF11）。高脂高糖饲料饲养4周后,连续3次腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素（STZ）,建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型,持续高脂高糖饲料饲养4周后,小动物超声检测心功能,取心肌组织,TUNEL染色检测心肌组织凋亡比例,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果 糖尿病损伤显著下调左室射血分数和左室短轴缩短率,增加心肌凋亡率,而给予重组GDF11蛋白能够明显改善心功能并减轻心肌凋亡。结论 外源性的GDF11可以显著减轻糖尿病损伤后心肌凋亡水平,改善心功能。     

二甲双胍通过DEC1改善2型糖尿病小鼠脂代谢紊乱

【立论依据】 2型糖尿病(T2D)因胰岛素分泌相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低,表现高糖和高胰岛素并存的代谢病。常与肥胖、高血压、高血脂等共同发生发展。近年发现二甲双胍(metformin,M)不仅可下调血糖,改善胰岛素耐量,且具有抗炎、改善脂代谢的作用,但其中机制仍不清楚。转录因子DEC1与多种细胞功能如细胞的增殖和分化、自身免疫性疾病以及应激反应密切相关。新近发现:DEC1能与核受体(PXR/CAR/LXR/PPAR)的伴侣核受体RXRα结合,抑制代谢性核受体作用,Knockdown内源性DEC1后,明显增加LXR靶基因的表达,LXR在调节代谢脂类发挥重要作用,提示DEC1参与了体内物质代谢和能量代谢。本实验室发现,高糖和高胰岛素均能显著诱导小鼠脂肪和肝细胞DEC1表达,同时诱导脂质合成酶表达而抑制脂质分解酶表达;动物实验也显示在T2D小鼠脂肪和肝脏组织DEC1表达显著增加,给予二甲双胍能下调DEC1表达,并改善脂质代谢紊乱。因此提出二甲双胍通过DEC1改善T2D小鼠脂代谢紊乱的假设。 【设计思路】 在整体和离体水平研究并阐明二甲双胍通过DEC1改善T2D小鼠脂代谢紊乱。 【实验内容】 研究二甲双胍对T2D小鼠肝脏、脂肪组织和原代小鼠肝细胞脂质代谢紊乱的作用和机制。 【材料】 雄性C57小鼠分为对照组(C)、2型糖尿病组(T2D)和二甲双胍治疗组(T2D+M)3组,C组普通饮食,T2D组和T2D+M组高脂饮食, 第8周的第1天,腹腔注射30 mg/kg的链佐菌素,C组给予等体积溶剂1次,第9周的第1天,T2D+M组连续给予二甲双胍20 mg/(kg·d)灌胃4周,T2D给予等体积NS。第13周第1天处死小鼠。称重,取肝脏组织用油红O染色观察肝脏中性脂肪积累;提取肝脏和小肠S9成分,测定肝脏甘油三酯和总胆固醇含量;用蛋白质印迹法测定小鼠肝脏SREBP1c、ACC1和FAS以及Ces1d、Ces1e的蛋白表达水平。同时,培养原代小鼠肝细胞,在离体水平研究二甲双胍对小鼠肝细胞在高糖和高胰岛素脂质代谢的作用及其机制。 【可行性】 立项依据充分,前期结果支持,实验室有良好的经费和技术支持和保障。 【创新性】 首次提出以DEC1为靶标治疗2型糖尿病脂质代谢紊乱。     

五味子油对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠血糖的影响

目的 研究五味子油对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠血糖、胰岛细胞形态及功能影响。方法 高脂饲料联合2次ip小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠每天分别ig五味子油0.25、0.5、1.0 mg/kg,连续给药6周后检测大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平;HE染色法观察大鼠胰腺病理形态学改变;免疫组织化学方法检测大鼠胰腺细胞胰岛素的表达;RT-PCR法检测大鼠胰腺组织胰岛素和胰十二指肠同源盒因子（PDX-1）mRNA表达水平。结果 五味子油可显著降低糖尿病大鼠的血糖水平,其高剂量组可使血糖恢复至正常水平;提高胰岛素分泌水平,显著提高胰岛素敏感指数,改善胰岛素抵抗;可减轻糖尿病大鼠胰腺病理学改变,使变小的胰岛体积增大、胰岛β细胞数目增多、胰岛素表达提高;还可提高糖尿病大鼠胰腺组织胰岛素和PDX-1 mRNA表达水平。结论 五味子油可以改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗,减轻胰岛β细胞的损伤,增加β细胞数量,改善β细胞的功能缺陷,提高胰岛素的分泌量,增加胰岛素和PDX-1 mRNA表达,从而产生降血糖作用。     

运动训练联合黄芩苷干预高脂小鼠胰岛素抵抗的实验研究

【目的】 胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病的全过程,是2型糖尿病的病理学基础。骨骼肌是机体最大的胰岛素靶器官,是转运葡萄糖的主要场所,胰岛素抵抗的发生与骨骼肌相关性引起我们的兴趣。本课题拟建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛素抵抗模型,用黄芩苷和运动训练进行干预,初步观察药物和运动干预对肥胖小鼠胰岛素抵抗的影响。 【方法】 将64只健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为8组,正常喂食:空白组、运动组、黄芩苷组、运动+黄芩苷组;高脂喂食:高脂空白组、高脂运动组、高脂黄芩苷组、高脂运动+黄芩苷组。用高脂饲料喂养高脂组小鼠14周,测定体重、空腹血糖和糖耐量、胰岛素耐量指标,建立高脂小鼠模型,同时以正常饲料喂养正常组小鼠14周作为对照。 随之,给予相应组别灌胃黄芩苷或者进行运动训练11周,分别测定各组小鼠体重、空腹血糖、餐后血糖和血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肌酸激酶等含量。取骨骼肌制作切片,油红染色观察脂质沉积的情况。黄芩苷剂量为(每日200 mg/kg);运动组小鼠用YLS-10B轮转式疲劳仪进项训练,20转/min,50 min/d,5 d/周。 【结果】 与高脂空白组相比,高脂黄芩苷组小鼠的体重、空腹血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显下降,血清高密度脂蛋白明显升高,脂质沉积减少;与高脂空白组相比,高脂运动组小鼠的血清甘油三酯和低密度脂蛋白均明显下降,体重、空腹血糖、总胆固醇都有下降趋势,脂质沉积减少。与高脂运动组相比,高脂运动+黄芩苷组小鼠的空腹血糖和总胆固醇明显下降,体重、甘油三酯、低密度脂蛋白有下降趋势,高密度脂蛋白有升高趋势,脂质沉积减少。 【结论】 黄芩苷和运动训练对高脂小鼠均具有降脂作用、对高脂小鼠的异常糖代谢均具有改善空腹血糖和餐后血糖的作用,可能与改善骨骼肌的胰岛素抵抗有关。     

TRPM2在机械性创伤引发单核细胞TNF-α过量产生中的作用及其机制

【立论依据】 车祸、地震等造成的机械性创伤(MT),可以造成心脑等重要器官的继发性损伤。前期的研究表明,MT引发的TNF-α过量产生是导致继发性心肌损伤的关键环节,然而其机制却不清楚。TRPM2是非选择性阳离子通道,在氧化应激情况下开放。由于单核细胞是产生TNF-α的主要细胞,故本课题以TRPM2为切入点,研究MT引发单核细胞TNF-α过量产生的机制。 【设计思路】 依次解决下述三个问题:(1)TRPM2在MT引发单核细胞TNF-α过量产生中是否发挥重要的作用?(2)TRPM2在MT引发TNF-α过量产生中的作用机制,主要观察通过TRPM2通道的开放是否与UCP2有关?(3)通过该通道内流的钙离子,是否通过ErK/NF-κB通路介导TNF-α的过量产生? 【实验内容】 (1)在培养的单核细胞液中,分别使用TRPM2通道阻断剂、Ca²⁺清除剂、相关溶剂和基因沉默技术,观察在培养液中添加创伤动物血浆(TP)引发的培养液中TNF-α浓度的变化;(2)使用TRPM2基因敲除鼠,观察MT造成的动物血浆中TNF-α浓度变化;(3)使用膜片钳和检测细胞内钙变化,从功能上观察在单核细胞上的TRPM2通道,是否参与TP引起的钙离子内流;(4)动物实验,观察MT后,UCP2的蛋白表达是否增强;使用UCP2抑制剂,观察MT后血浆TNF-α产生量的变化;(5)膜片钳观察,使用UCP2抑制剂,观察是否可抑制TP引起的单核细胞TRPM2通道开放和细胞内钙上升;(6)单核细胞培养,使用TRPM2阻断剂和siRNA基因沉默TRPM2,观察培养液中添加TP后,对ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况;(7)动物实验,观察TRPM2基因敲除鼠和对照鼠,创伤后ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况。 【材料】 使用雄性成年C57B16/J小鼠和TRPM2基因敲除鼠。 【可行性】 (1)申请人所在实验室具有完成上述实验的全部实验仪器,本课题组实验技术成熟,人员配备较好。(2)实验所用TRPM2基因敲除鼠可以从日本国立自然科学研究机构获得。 【创新性】 (1)以TRPM2为靶点,研究其在MT引发TNF-α过量产生中的作用。(2)研究TRPM2通道与UCP2的关系。(3)观察TRPM2通道是否通过ErK/NF-κB通路介导MT引发的TNF-α过量产生。     

利用乳腺特异表达微RNA转基因小鼠探索乳汁微RNA对子代个体发育的影响

【立论依据】 乳汁是新生儿及婴儿阶段重要的营养来源,其中含有多种免疫球蛋白、脂类以及生长因子等免疫、营养相关物质。近年发现,在哺乳动物乳汁中存在丰富的微RNA(microRNA)。微RNA主要发挥转录后水平基因表达调控作用,参与了多种生理病理过程。目前研究多集中于对乳汁中微RNA存在的证实与含量的检测,尚未见基于直接实验证据获得的乳汁中微RNA对子代个体生长发育作用的报道。据此,我们拟利用转基因模式小鼠对乳汁微RNA是否对子代个体生长发育有影响进行探索。 【设计思路】 首先,针对乳腺特异表达微RNA(miR-X)转基因小鼠乳腺组织及乳汁中miR-X进行定量;其次,利用该miR-X转基因小鼠及野生型小鼠分别哺育野生型新生小鼠,通过对新生小鼠生长发育情况的检测,初步判定乳汁miR-X对子代发育的影响;最后,检测新生小鼠主要脏器miR-X靶基因表达情况。 【实验内容】 利用已建立的乳腺特异表达miR-X的转基因小鼠,分别进行基因组、乳腺组织以及乳汁的外源基因整合情况检测及miR-X的表达及含量检测。实验组用阳性雌鼠哺育野生型新生小鼠,观察并记录小鼠生长发育情况;对照组用野生型雌鼠哺育野生型新生小鼠,观察并记录小鼠生长发育情况。4周后处死部分子代小鼠,取其肝脏等主要脏器,测定miR-X相关靶基因表达情况。 【材料】 乳腺特异表达miR-X转基因雌鼠8只,野生型雌鼠(C57Bl/6)8只及用于合笼繁殖的野生型雄鼠; 【可行性】 乳汁微RNA的存在已被多项研究所证实,为本项目的提出提供了依据;乳汁中营养成分对子代个体的生物学作用已被证实,其中微RNA也必将具有一定的生物学作用。项目组所在实验室具有相关研究经验和仪器设备可保障实验的实施。乳腺特异表达微RNA转基因小鼠的建立为本项目提供了直接可靠的实验材料。 【创新性】 乳汁微RNA对子代个体发育的功能研究将丰富人们对乳汁功能的认识,为改良母乳替代品配方提供了更加直观的依据,为奶制品新的质量检测指标的提出提供了理论基础。此外,乳腺特异表达微RNA转基因小鼠是该项目的重要材料,也是本项目的特色。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

心肌线粒体改变对1型糖尿病小鼠心脏结构与功能的影响

目的 探讨心肌线粒体改变对1型糖尿病小鼠心脏结构与功能的影响。方法 20只8周龄雄性C57/BL6J小鼠随机分为对照组（n=10）,1型糖尿病组（n=10）。单次腹腔注射STZ（150mg/kg）建立1型糖尿病动物模型,实验到达终点时采用小动物用高分辨超声仪观察小鼠心脏结构,测量心脏功能;光镜下观察心肌细胞形态改变,透射电镜下观察心肌细胞线粒体变化,Western blot法检测线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α。原代培养C57BL/6J乳鼠心肌细胞,观察在不同糖浓度（5mmol/L、33mmol/L）中培养48h后心肌细胞的形态学变化,透射电镜下观察心肌细胞线粒体的改变,Western blot法检测线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α。结果 与正常组小鼠相比,1型糖尿病组小鼠心肌线粒体排列不规则,肿胀,脊脱落溶解,线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α表达减低（P< 0.05）,1型糖尿病小鼠心脏肥大,室壁增厚,心功能减低。与正常糖浓度培养组相比,高糖培养组线粒体肿胀、脊断裂溶解,线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α表达减低（P<0.05）,心肌细胞肥大显著,形态欠规则。结论 心肌线粒体结构与功能的改变与1型糖尿病小鼠心脏结构与功能改变有关。