伊拉地平对 MPP＋损伤 PC12细胞保护作用的实验研究

目的：研究伊拉地平（ ISR ）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（ MPP＋）损伤的PC12细胞的保护作用及可能机制。方法MPP ＋处理PC12细胞建立帕金森病细胞模型;4-甲基偶氮唑蓝（ MTT）比色法检测细胞存活率;双氯荧光黄乙酸乙酯（ DCFH-DA）染色流式细胞术检测细胞内活性氧（ ROS）的生成;JC-1染色流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（ MMP）。结果1 mmol · L－1MPP＋处理PC12细胞24 h后能明显抑制细胞生长（P＜0．01）;降低线粒体膜电位;ROS含量增加。2μmol· L－1伊拉地平预处理后, PC12细胞存活率显著增加（ P＜0．01）;线粒体膜电位升高;ROS生成减少。结论伊拉地平对MPP＋损伤的PC12细胞具有保护作用,其作用机制可能与维持线粒体正常膜电位,稳定线粒体功能,阻止线粒体氧化应激发生有关。     

MPP 诱导PC12细胞发生Ferroptosis（铁死亡）的实验观察

[摘要] 目的 1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenyl pyridine,MPP ）诱导PC12细胞铁死亡（Ferroptosis）的研究。方法：采用MTT法检测细胞存活率和筛选Ferrostatin-1的最佳作用浓度;倒置显微镜观察Ferrostatin-1对PC12细胞的保护作用;MDC染色检测细胞自噬;ELISA法检测caspase-3的酶活性;流式细胞术检测活性氧ROS流式细胞术检测活性氧ROS。结果 研究结果表明1mmol/L MPP 对PC12细胞有明显抑制作用;5μmol/L Ferrostatin-1能够明显提高PC12细胞的存活率;倒置显微镜观察结果表明Ferrostatin-1预保护后,PC12细胞损伤明显减少;MDC染色检测细胞自噬和ELISA法检测caspase-3的酶活性结果显示Ferrostatin-1对MPP 诱导的PC12细胞自噬和凋亡的保护作用不明显;ROS活性氧检测结果显示ROS在胞内增加,可能发生氧化应激,加Ferrostatin-1后ROS荧光强度减弱。ROS活性氧检测结果显示ROS在胞内增加,可能发生氧化应激,加Ferrostatin-1后ROS荧光强度减弱。结论 铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能够显著抑制MPP 诱导的PC12细胞损伤,且Ferrostatin-1对细胞的自噬和凋亡作用不明显,推测出MPP 损伤PC12细胞的帕金森病模型中可能有铁死亡的存在。     

瓜子金皂苷己对MPP~+诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的观察瓜子金皂苷己(polygalasaponin F,PS-F)对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的PC12细胞损伤的影响,并且探讨其作用机制。方法 MTT法检测细胞存活率,Annexin V/PI染色流式细胞术检测PC12细胞凋亡,JC-1染色倒置显微镜检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),Western blot检测Caspase-3蛋白的水平。结果 500μmol.L-1MPP+作用PC12细胞48 h,能明显抑制细胞生长(P<0.01),诱导细胞发生凋亡,同时降低MMP,增加活性Caspase-3的蛋白水平。同时给予不同浓度PS-F处理,PC12细胞存活率增加(P<0.01);凋亡细胞量减少;MMP增高;活性Caspase-3蛋白水平降低(P<0.01)。结论 PS-F能抑制MPP+诱导的PC12细胞的凋亡,其作用机制可能与维持线粒体正常膜电位,稳定线粒体功能,降低活性Caspase-3蛋白水平有关。     

瓜子金皂苷丙对MPP~+诱导PC12细胞凋亡的抑制作用

目的观察瓜子金皂苷丙对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的影响,并且探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞存活率,碘化丙啶染色流式细胞术(FCM)检测PC12细胞凋亡,Western blotting检测Bax和Bcl-2蛋白的表达,罗丹明123染色FCM检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm),荧光酶标仪检测细胞内活性氧(R0S)的含量。结果不同浓度MPP+作用PC12细胞24 h后,细胞存活率显著下降(P<0.01),细胞凋亡明显,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比之下降,线粒体膜电位降低,细胞内ROS显著增加。与MPP+处理组相比,瓜子金皂苷丙10μmol·L-1组,细胞存活率显著升高(P<0.01);细胞凋亡率下降(P<0.01);Bcl-2/Bax比率增加(P<0.01),线粒体膜电位上升(P<0.01),ROS含量减少。结论瓜子金皂苷丙可以抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡,其作用机理可能与上调Bcl-2和下调Bax蛋白的表达,维持线粒体正常膜电位,稳定线粒体功能,清除R0S有关。     

1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞发生铁死亡的实验观察

目的 进行1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridine,MPP+)诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞铁死亡(Ferroptosis)的研究.方法 采用噻唑蓝法(MTT)检测细胞存活率和筛选铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)的最佳作用浓度;倒置显微镜观察Ferrostatin-1对PC12细胞的保护作用;MDC染色检测细胞自噬;ELISA法检测caspase-3的酶活性;流式细胞术检测活性氧ROS.结果 1 mmol·L-1 MPP+对PC12细胞有明显抑制作用;5 μmol·L-1 Ferrostatin-1能够明显提高PC12细胞的存活率;倒置显微镜观察结果表明Ferrostatin-1预保护后,PC12细胞损伤明显减少;MDC染色检测细胞自噬和ELISA法检测caspase-3的酶活性结果显示Ferrostatin-1对MPP+诱导的PC12细胞自噬和凋亡的保护作用不明显;ROS活性氧检测结果显示ROS在胞内增加,可能发生氧化应激,加Ferrostatin-1后ROS荧光强度减弱.结论 Ferroptosis能够显著抑制MPP+诱导的PC12细胞损伤,且Ferrostatin-1对细胞的自噬和凋亡作用不明显,推测出MPP+诱导PC12细胞的损伤可能有Ferroptosis的存在.     

7,8-二羟基-4-甲基香豆素对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用

目的探讨7,8-二羟基-4-甲基香豆素(Dhmc)对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用。方法采用谷氨酸诱导PC12细胞损伤凋亡模型,给予Dhmc处理后,MTT法检测细胞增殖;化学检测法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、细胞上清液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)水平;采用Annexin-V-FITC双染法检测细胞凋亡率;采用荧光法检测活性氧(ROS)的生成;采用流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP);Western blot法检测Bcl-2、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3蛋白表达。结果 Dhmc可显著降低由谷氨酸诱导的细胞损伤,提高了细胞存活率,减少LDH漏出量,降低MDA含量,增加SOD活性,抑制ROS的生成,维持线粒体膜电位水平,下调Bcl-2/Bax比率,减少Cyt C的释放,降低Caspase-3活性。结论 Dhmc具有减轻由谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的作用,其机制可能与抗氧化应激和减轻线粒体损伤有关。     

α-硫辛酸注射液对过氧化氢致PC12细胞损伤的保护作用

目的 研究α-硫辛酸注射液(抗氧化剂)对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用.方法 600 μmol·L-1H2O2与细胞共同孵育4 h,建立PC12细胞氧化应激损伤模型,用MTT法,测定细胞生长抑制率;培养介质中的LDH测定,用紫外分光光度法,用流式细胞术测定细胞凋亡率和线粒体膜电位.结果 与模型组相比,3个剂量(10,1 μmol·L-1)α-硫辛酸注射液能提高H2O2损伤的PC12细胞的存活率,减少LDH的漏出,降低细胞凋亡率,抑制线粒体膜电位的下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 α-硫辛酸注射液对H2O2致PC12细胞损伤模型具有较好的保护作用.     

二氢石蒜碱对过氧化氢损伤的PC12细胞的保护作用

目的:探讨二氢石蒜碱(DL)对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响及其可能机制。方法:用H2O2(200μmol.L-1)处理PC12细胞建立氧化应激模型,并加入二氢石蒜碱预处理作为保护。噻唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞存活率和细胞损伤程度,利用荧光探针DCFH-DA和JC-1分别检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位。结果:H2O2作用于PC12细胞后,细胞存活率下降,LDH活性和ROS含量增高,线粒体膜电位降低,与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.01);10-7～10-5mol.L-1DL预处理后,细胞存活率提高,LDH和ROS变低,线粒体膜电位回升,且在一定范围呈剂量依赖性。结论:DL对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤具有保护作用,其作用机制可能与减少ROS产生和稳定线粒体膜电位有关。     

右美托咪定对抗化学性低氧引起的PC12细胞损伤

目的探讨α2肾上腺素受体激动剂右美托咪定能否保护PC12细胞对抗化学性低氧引起的损伤。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞以建立化学性缺氧损伤模型。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Ho-chest 33258核染色法观察细胞凋亡的形态学和数量的改变;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜检测细胞内的活性氧(ROS)水平;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜检测线粒体膜电位(MMP)。结果在浓度为100～600μmol.L-1的范围内,右美托咪定浓度依赖性地对抗CoCl2引起的细胞毒性,使细胞存活率明显增加。400μmol.L-1右美托咪定能抑制CoCl2的致凋亡作用,使凋亡细胞数量减少。右美托咪定也能抑制CoCl2引起的ROS过度生成及MMP降低的作用。结论右美托咪定能保护PC12细胞对抗CoCl2诱导的损伤,此作用可能与其抑制ROS过度生成及保护MMP有关。     

新型孕激素衍生物3α-羟基-3β-甲氧基甲基-16,17-亚甲基-孕甾-20-酮对硝普钠损伤PC12细胞的保护作用

目的探讨新型孕激素衍生物3α-羟基-3β-甲氧基甲基-16,17-亚甲基-孕甾-20-酮(CPU)对硝普钠(SNP)诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用及其机制。方法用终浓度为0.01,0.10,1.00μmol·L-1的CPU预处理30 min,然后加入SNP共同作用24 h。采用MTT法检测细胞存活率,分光光度计法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化;流式细胞仪检测活性氧(ROS)、线粒体膜电位和细胞凋亡率;Western蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax和活化的胱天蛋白酶3蛋白表达水平。结果与细胞对照组比较,SNP模型组PC12细胞的存活率显著降低,LDH的释放明显增加(P<0.01),MDA生成增多,SOD活性降低,ROS水平升高,线粒体膜电位水平降低,细胞凋亡率由细胞对照组(1.20±0.14)%增加至(55.52±3.56)%(P<0.01);Bcl-2蛋白表达降低,而Bax表达升高,Bax/Bcl-2比值升高,同时胱天蛋白酶3被激活(P<0.01)。与模型组比较,CPU 0.01,0.10和1.00μmol·L-1作用24 h后,细胞存活率显著升高,LDH的释放减少(P<0.01),MDA的生成量减少,SOD活性增加,ROS累积减少,线粒体膜电位水平升高(P<0.01);凋亡细胞分别降至(37.79±4.85)%,(22.31±4.25)%和(10.39±2.65)%;Bcl-2蛋白表达增加,Bax和活化的胱天蛋白酶3表达降低。结论 CPU对SNP所致损伤的PC12细胞有一定的保护作用,其作用机制可能与其抗氧化和抗凋亡作用有关。     

毛蕊花苷对MPP~+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察肉苁蓉提取物毛蕊花苷对MPP+诱导的SHSY5Y细胞损伤的影响。方法用MTT法检测细胞存活率,以流式细胞仪检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,以及细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性,蛋白印迹测定Bcl-2的表达水平。结果200μmol·L-1MPP+处理细胞24h降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达38.9%;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性升高;而线粒体膜电位却明显降低。而预先给予0.1、1或者10mg·L-1浓度的毛蕊花苷处理细胞12h,可提高细胞存活率;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到29.5%,15.3%和8.6%,而且细胞内活性氧的水平明显降低,并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;caspase-3的活性不断降低,Bcl-2的表达水平增高,并呈现一定的剂量依赖性。结论毛蕊花苷能抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。     

硫化氢通过抑制p38 MAPK保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤

目的探讨硫化氢(H2S)是否通过抑制p38MAPK保护PC12细胞对抗化学性缺氧诱导的损伤。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Hochest33258核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照像检测细胞内的活性氧(ROS);罗丹明123(RH123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);Western blot法检测p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol·L-1CoCl2处理PC12细胞2h可使磷酸化(p)p38明显增多;在应用600μmol·L-1CoCl2处理PC12细胞前30min,应用400μmol·L-1硫氢化钠(NaHS,H2S的供体)预处理细胞不仅可明显的抑制CoCl2诱导的p-p38MAPK表达的增多,还能保护PC12细胞对抗600μmol·L-1CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞和胞内ROS水平明显降低,MMP丢失减小;在CoCl2损伤PC12细胞前60min应用p38抑制剂SB302580(20μmol·L-1)预处理也能产生类似NaHS预处理的细胞保护作用。结论 p38MAPK介导CoCl2引起PC12细胞的损伤作用;H2S通过抑制p38MAPK的表达及氧化应激反应保护PC12细胞对抗化学性缺氧引起的损伤作用。     

硫化氢抑制葡萄糖调节蛋白78减轻6-OHDA诱导的PC12细胞损伤

目的：探讨硫化氢（H2S）是否通过改变葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达参与其对抗6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PC12细胞损伤的保护作用。方法应用具有神经毒性的6-OHDA损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型,以硫氢化钠（NaHS）作为H2S的供体;应用CCK-8比色法检测细胞存活率;DFCH-DA染色检测细胞内活性氧（ROS）的水平;Rh123染色检测细胞线粒体膜电位（MMP）;Western blot检测GRP78的表达。结果200μmol/L的6-OHDA引起PC12细胞的存活率显著降低,ROS生成增加及MMP降低,且诱导了GRP78的高表达。应用25~400μmol/L的NaHS预处理30 min,呈浓度依赖性抑制6-OHDA引起的细胞存活率降低,其中400μmol/L的NaHS作用最明显,此浓度也可以显著减少6-OHDA引起的ROS增多,提高MMP,同时明显抑制6-OHDA诱导的GRP78高表达。结论 H2S具有抗6-OHDA氧化应激损伤的PC12细胞保护作用,抑制内质网应激分子GRP78的表达可能是其机制之一。     

Synergistic effects of hydrogen peroxide and ethanol on cell viability loss in PC12 cells by increase in mitochondrial permeability transition

The promoting effect of ethanol against the cytotoxicity of hydrogen peroxide (H2O2) in differentiated PC12 cells was assessed by measuring the effect on the mitochondrial membrane permeability. Treatment of PC12 cells with H2O2 resulted in the nuclear damage, decrease in the mitochondrial transmembrane potential, cytosolic accumulation of cytochrome c, activation of caspase-3, increase in the formation of reactive oxygen species (ROS) and depletion of GSH. In PC12 cells and dopaminergic neuroblastoma SH-SY5Y cells, the promoting effect of ethanol on the H2O2-induced cell death was increased with exposure time. Ethanol promoted the nuclear damage, change in the mitochondrial membrane permeability, ROS formation and decrease in GSH contents due to H2O2 in PC12 cells. Catalase, carboxy-PTIO, Mn-TBAP, N-acetylcysteine, cyclosporin A and trifluoperazine inhibited the H2O2 and ethanol-induced mitochondrial dysfunction and cell injury. The results show that the ethanol treatment promotes the cytotoxicity of H2O2 against PC12 cells. Ethanol may enhance the H2O2-induced viability loss in PC12 cells by promoting the mitochondrial membrane permeability change, release of cytochrome c and subsequent activation of caspase-3, which is associated with the increased formation of ROS and depletion of GSH. The findings suggest that ethanol as a promoting agent for the formation of mitochondrial permeability transition may enhance the neuronal cell injury caused by oxidants.     

Protocatechuic acid inhibits apoptosis by mitochondrial dysfunction in rotenone-induced PC12 cells.

Protocatechuic acid (PCA), a phenolic compound isolated from the kernels of Alpinia (A.) oxyphylla, showed the significant neuroprotective effects on hydrogen peroxide (H2O2) or MPP+-induced apoptosis in cultured PC12 cells. However, the mechanism how PCA suppresses rotenone-induced neurotoxicity in cultured PC12 cells remains unclear. In this study, we investigated the protective effects of PCA in PC12 cells exposed to rotenone as an in vitro model of mitochondrial dysfunction and apoptotic cell death. The apoptosis in rotenone-induced PC12 cells was accompanied by the loss of mitochondrial membrane potential, the formation of reactive oxygen species (ROS), the total glutathione depletion, activation of caspase-3 and down-regulation of Bcl-2. In contrast, PCA markedly attenuated the above-mentioned mitochondrial dysfunction in a dose-dependent manner. Taken together, these results suggest that treatment of PC12 cells with PCA can block rotenone-induced apoptosis via ameliorating the mitochondrial dysfunction.     

神经妥乐平对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用

目的 探索神经妥乐平对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤的影响及其潜在机制.方法 用CCK-8法检测细胞存活率,以流式细胞术检测细胞氧化损伤的发生、细胞内活性氧的生成及线粒体膜电位的变化,荧光显微镜观察细胞内活性氧的产生,qRT-PCR测定Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表达.结果 PC12细胞存活率随H2O2浓度的增加而逐渐下降.其中,450μM H2O2处理细胞24 h后细胞存活率、凋亡率、坏死率明显降低;细胞内活性氧水平表达明显升高;线粒体膜电位JC-1红/绿荧光比值下降;Bax和Caspase-3的mRNA表达升高,而Bcl-2的mRNA表达下降,以上指标与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).而预先给予0.01UN/ml的NTP处理细胞12h可明显提高细胞存活率,降低细胞凋亡率和坏死率,减少细胞内活性氧生成并提高线粒体膜电位,抑制Bax和Caspase-3的mRNA表达,促进Bcl-2 mRNA的表达,以上指标与H2O2组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NTP能抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平、维持线粒体膜电位的高能状态和抑制促凋亡基因表达、促进抗凋亡基因表达有关.     

Piperine inhibition of 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced mitochondrial dysfunction and cell death in PC12 cells

The effect of alkaloid piperine against the toxicity of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP(+)) in differentiated PC12 cells was assessed. Piperine treatment revealed a differential effect on the cytotoxicity of MPP(+) and had its maximum inhibitory effect at 1 microM. The addition of piperine (0.5-10 microM) significantly reduced the MPP(+)-induced nuclear damage, mitochondrial membrane permeability changes, formation of reactive oxygen species and depletion of GSH. In contrast, piperine at 50-100 microM showed cytotoxicity and exhibited an additive effect against the MPP(+) toxicity. The results indicate that piperine had a differential effect on the cytotoxicity of MPP(+) depending on concentration. Piperine at low concentrations may reduce the MPP(+)-induced viability loss in PC12 cells by suppressing the changes in the mitochondrial membrane permeability, leading to the release of cytochrome c and subsequent activation of caspase-3. The effects may be ascribed to its inhibitory action on the formation of reactive oxygen species and depletion of GSH.