转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响

目的构建转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)基因短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF-β1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列,并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-β1a、pshRNA-TGF-β1b和pshRNA-TGF-β1c(阴性对照),以脂质体介导转染SW480细胞,荧光显微镜观察转染情况;RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果 TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比,3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达;pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低(P<0.05);SW480细胞的侵袭能力也明显降低(P<0.05)。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒,其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达,并可显著降低细胞的侵袭能力,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

沉默血管内皮钙黏蛋白基因对人高转移肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移的影响

目的探讨沉默血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)基因对人高转移肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移的影响。方法将携带3种不同抑制靶点的VE-cadherin基因沉默重组质粒GV248-shRNA-VEcadherin(1)、(2)、(3)分别转染至人高转移肝癌HCCLM3细胞,同时设阴性对照组(转染空载体质粒GV248-shRNANC)和空白对照组(未转染)。采用qRT-PCR及Western blot法分别检测各组细胞中VE-cadherin基因mRNA转录及蛋白的表达水平,同时筛选出最有效的靶点。MTT法测定各组细胞的体外增殖能力;Transwell小室试验检测各组细胞的迁移能力。结果与空白对照组及阴性对照组比较,3组转染VE-cadherin-shRNA干扰质粒的HCCLM3细胞的VE-cadherin基因mRNA转录及蛋白表达水平显著降低(P0.05),其中GV248-shRNA-VE-cadherin(1)的VEcadherin基因抑制率最高(P0.05),筛选为最佳靶点;最佳靶点干扰组HCCLM3细胞的增殖及迁移能力均明显降低(P0.05)。结论沉默VE-cadherin基因可显著抑制人高转移肝癌HCCLM3细胞的增殖及迁移。     

RNA干扰整合素连接激酶基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨沉默整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。方法将ILK siRNA表达质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染人舌鳞癌Tb细胞,稳定表达细胞株分别命名为Tb siILK和Tb vector组,并设正常Tb细胞对照组(Tb组)。Western blot法检测细胞中ILK蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测细胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表达;光镜和HE染色观察细胞的形态学变化;划痕试验检测细胞的迁移能力;Transwell法检测细胞的侵袭能力;流式细胞术检测细胞的细胞周期和凋亡情况;MTT法检测细胞的增殖活力;Western blot法检测沉默ILK基因后细胞中p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3α/β、Snail的表达。结果与Tb和Tb vector组相比,Tb siILK组细胞中ILK蛋白的表达水平显著降低(P<0.01);ILK、p-Akt、p-GSK3β在胞质中的荧光信号明显减弱;大部分细胞的上皮形态特征更为明显;细胞的迁移距离和侵袭细胞数显著减少(P<0.05);G2-M期和G0-G1期细胞比例均显著增加(P<0.01);细胞的增殖活力显著减低;ILK基因沉默后,细胞中p-Akt、p-GSK3β和Snail蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。3组细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论抑制ILK基因的表达可通过Akt/GSK3β/Snail途径显著抑制人舌鳞癌Tb细胞的生长、迁移和侵袭能力,ILK有望作为治疗人舌鳞癌的靶基因。     

DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞中ALK2基因mRNA的转录;分别以腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞,并设空白对照组,通过MTT法、平板集落形成试验、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验检测细胞的增殖、集落形成、迁移及侵袭能力。结果 MDA-MB-231细胞中内源性表达ALK2。腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞36 h后,荧光表达量一致,约为70%。MDA-MB-231/DN-ALK2细胞中高表达DN-ALK2。与MDA-MB-231/RFP组相比,MDA-MB-231/DN-ALK2组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低(P<0.05),穿膜细胞数也明显减少(P<0.05);而MDA-MB-231/RFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论DN-ALK2可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移与侵袭。     

PML(NLS~-)干扰对HL-60细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨缺失核定位信号的PML,即PML(NLS-)干扰对急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响。方法将靶向PML(NLS-)基因的3组干扰质粒pGpu6-PML(NLS-)shRNA和阴性对照质粒pGpu6-NCshRNA分别转染HL-60细胞,转染后48 h,G418筛选阳性克隆,分别命名为Si-1、Si-2、Si-3和NC组,并设空白对照组。采用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分析细胞的细胞周期及凋亡情况。结果 Si-1和Si-2组HL-60细胞PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平与空白对照组相比明显减低(P<0.05),有干扰效果;Si-1组HL-60细胞的增殖水平与空白对照组相比明显降低(P<0.05),以转染后48 h降低最为显著(P<0.01);抑制PML(NLS-)表达可引起HL-60细胞S期比例增高,G1和G2期比例下降(P<0.05);Si-1组细胞凋亡率明显高于NC组和空白对照组(P<0.05)。结论干扰PML(NLS-)的表达可促进HL-60细胞的凋亡,抑制其增殖。     

Musashi2对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响

目的探讨Musashi2(Msi2)对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响。方法将靶向Msi2基因的si-RNA1、siRNA2及阴性对照序列转染K562细胞,同时设空白对照组(未转染的K562细胞)。实时荧光定量PCR法及Western blot法分别检测K562细胞中Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平;经细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;细胞黏附试验检测K562细胞体外黏附能力;Transwell试验检测K562细胞体外迁移及侵袭能力。结果与阴性对照组及空白对照组比较,Msi2-1及Msi2-2组K562细胞中的Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),体外黏附、迁移、侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结论抑制Msi2的表达可显著抑制白血病K562细胞的体外侵袭能力,本实验为进一步研究Msi2在白血病发生发展中的调控机制奠定了基础。     

单-ADP-核糖基转移酶3过表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡及侵袭的影响

目的探讨单-ADP-核糖基转移酶3(mono-ADP-ribosyltransferase 3,ART3)过表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法在Lipofectamine 2000的介导下,将ART3基因重组真核表达质粒pCMV-ART3-myc-tag转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,用G418进行稳定转染细胞株的筛选,同时设未转染组对照。Western blot法检测稳定转染细胞中ART3-myc-tag蛋白的表达,MTT法、流式细胞术和Transwell试验分别检测ART3对MDA-MB-231细胞增殖活力、凋亡及侵袭能力的影响。结果 ART3可在MDA-MB-231细胞中稳定过表达;ART3转染组细胞的增殖活力和侵袭能力均明显高于未转染组(P0.05);ART3转染组细胞的凋亡率明显低于未转染组(P0.05)。结论过表达ART3能促进乳腺癌细胞增殖、侵袭,并抑制其凋亡,本实验为进一步研究ART3基因在乳腺癌发生发展中的作用及其机制奠定了基础。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

重组腺病毒介导的FOXO/MDA-7对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨重组腺病毒介导的FOXO/MDA-7对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制。方法将MDA-MB-231细胞分为Ad-FOXO/MDA-7组、Ad-FOXO组、Ad-MDA-7组和空白对照组,采用Real-time PCR、q RTPCR和Western blot法检测各组细胞中FOXO和MDA-7基因的转录及蛋白表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Transwell法检测细胞的侵袭能力;Western blot法检测细胞中Ras、Raf、MEK和ERK蛋白的表达情况。结果与其他各组相比,转染Ad-FOXO/MDA-7后,MDA-MB-231细胞中FOXO和MDA-7的表达明显增强,细胞的增殖活力和侵袭能力明显被抑制(P0.05),凋亡率明显升高,细胞中Ras、Raf、MEK和ERK蛋白的表达也明显被抑制。结论重组腺病毒Ad-FOXO/MDA-7能明显促进乳腺癌细胞的凋亡,为乳腺癌的基因治疗提供了新的思路。     

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对HEK293细胞凋亡的影响

目的探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用。方法取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、pcDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒pcDNA3.1(-),作为阴性对照]、Poly I∶C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly I∶C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104 U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平。结果瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβmRNA的水平显著上调。结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡。     

α-甘露糖苷酶Ⅱ基因沉默对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因的表达对人胃癌BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。方法根据GenBank中登录的人GMⅡ基因mRNA序列及siRNA设计原则,设计了4条siRNA,并构建4个针对靶点的重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-1140、pGPU6/GFP/Neo-1303、pGPU6/GFP/Neo-1406和pGPU6/GFP/Neo-1817,同时合成阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC,经Lipofectamine 2000分别转染BGC-823细胞,通过RT-PCR及Western blot检测转染细胞中GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达,筛选沉默效果最佳的质粒;经MTT试验、细胞周期分布分析、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI双染试验分别检测沉默GMⅡ基因对人BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。结果 pGPU6/GFP/Neo-1303组GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),表明pGPU6/GFP/Neo-1303组沉默效果最好;与空白对照组和阴性对照组相比,pGPU6/GFP/Neo-1303组BGC-823细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01),G1期细胞比例明显上升(P<0.05),S期细胞比例明显下降(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论已成功沉默BGC-823细胞中GMⅡ基因的表达,从而抑制BGC-823细胞的增殖并促进其凋亡,GMⅡ可能成为防治胃癌的新靶点。     

MMP-2反义寡核苷酸对人胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌SGC7901细胞增殖及侵袭能力的影响。方法将不同浓度的硫代磷酸化修饰的MMP-2ASODN转染入人中低分化胃腺癌SGC7901细胞株,RT-PCR法检测细胞MMP-2基因mRNA的转录水平;Transwell试验检测细胞体外迁移和侵袭能力变化;MTT法检测细胞的增殖活性。结果转染MMP-2ASODN后,SGC7901细胞中MMP-2基因mRNA的转录水平显著降低,细胞的体外迁移和侵袭能力受到抑制,且抑制作用随ASODN浓度的增加而增强;而细胞的增殖活性无明显变化。结论MMP-2ASODN可抑制胃腺癌SGC7901细胞MMP-2基因mRNA的转录水平及细胞的体外迁移和侵袭能力,但与胃癌细胞的增殖活性无明显相关性。     

Photoaffinity Labeling-Based Chemoproteomic Strategy Reveals RBBP4 as a Cellular Target of Protopanaxadiol against Colorectal Cancer Cells

Protopanaxadiol (PPD), a main ginseng metabolite, exerts powerful anticancer effects against multiple types of cancer; however, its cellular targets remain elusive. Here, we synthesized a cell-permeable PPD probe via introducing a bifunctional alkyne-containing diazirine photo-crosslinker and performed a photoaffinity labeling-based chemoproteomic study. We identified retinoblastoma binding protein 4 (RBBP4), a chromatin remodeling factor, as an essential cellular target of PPD in HCT116 colorectal cancer cells. PPD significantly decreased RBBP4-dependent trimethylation at lysine 27 of histone H3 (H3K27me3), a crucial epigenetic marker that correlates with histologic signs of colorectal cancer aggressiveness, and PPD inhibition of proliferation and migration of HCT116 cells was antagonized by RBBP4 RNA silencing. Collectively, our study highlights a previously undisclosed anti-colorectal cancer cellular target of the ginseng metabolite and advances the fundamental understanding of RBBP4 functions via a chemical biology strategy.     

靶向人Gadd45α基因的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞生物学功能损伤的影响

目的研究靶向人生长阻滞和DNA损伤45α(Growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α)基因和表达绿色荧光蛋白(Green fluorescert protein,GFP)的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells,HUVECs)表达上调的Gadd45α的沉默作用,初步阐明Gadd45α在缺氧应激致HUVECs生物学功能损伤过程中的作用。方法慢病毒包装后感染HUVECs,筛选最适MOI及感染时间。感染72h后,采用Real-time PCR和Western blot检测细胞中Gadd45αmRNA和蛋白的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Transwell小室实验检测细胞的迁移率;ELISA检测细胞sFlt-1和sEng的分泌水平。结果包装后慢病毒载体的滴度为1×108TU/ml,最适MOI为20,最适感染时间为72h,对HUVECs的感染效率约为80%。Gadd45α shRNA慢病毒载体对Gadd45α基因的沉默效率可达80%,阴性对照慢病毒载体对Gadd45α的表达无抑制作用。缺氧可致HUVECs中Gadd45α的表达上调,靶向Gadd45α基因的shRNA慢病毒颗粒可有效抑制缺氧致HUVECs的凋亡,减少sFlt-1及sEng的释放,同时增强其体外迁移能力,与缺氧组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Gadd45α蛋白的表达水平与sFlt-1及sEng的分泌水平呈正相关(r1=0.89,r2=0.77,P均<0.05)。结论沉默Gadd45α基因对缺氧应激条件下的HUVECs生物学功能具有保护作用;Gadd45α可能是一个关键上游位点,参与子痫前期时sFlt-1及sEng的释放。