cDNA疫苗预防寄生虫感染的优势与缺陷

近年来DNA疫苗技术的快速发展 ,为研制能有效激活机体的体液免疫和细胞免疫机制的多价疫苗提供了良好的前景。cDNA疫苗的出现为一些重要的寄生虫病 ,如疟疾、利什曼病、弓形虫病、血吸虫病、片形吸虫病的预防提供了可能性。然而接种疫苗的效果更多取决于疫苗的接种方式、剂量、接种途径、疫苗接种宿主的种甚至是株。为了解决上述问题 ,还需要作进一步的研究工作 ,尤其是后续新的cDNA序列的克隆及检测 ,基因组计划 ,疫苗的不同接种方法 ,包括免疫活化序列载体的设计以及对安全性的详尽研究     

狂犬病疫苗免疫人B细胞受体库的高通量测序分析北大核心CSCD

目的对志愿者接种商业化狂犬病病毒疫苗前后的B细胞受体库进行高通量测序,探讨志愿者接种前后B细胞受体库互补决定区3表达谱的变化情况,为了解B细胞生物学作用、评估疫苗作用等提供参考。方法以商业化狂犬病病毒疫苗分别注射4个志愿者,分离外周血单核细胞,提取PBMC总RNA,对总RNA进行逆转录获得cDNA,以cDNA为模板进行多重PCR,后通过Illumina HiseqtmXten(novaseq)平台进行高通量测序和生物信息学分析。结果通过接种RABV疫苗,志愿者BCR的多样性改变但变化无统计学意义。V/J区基因片段的序列使用频率以及V-J基因组合改变,其中IGHJ1基因与IGHV1-3、IGHV3-20、IGVH3-7和IGHV2-26使用频率升高,免疫前后差异有统计学意义;8个V-J组合在免疫前后差异有统计学意义。鉴定了疫苗免疫诱导B细胞克隆后高频扩增(>0.4%)的CDR3氨基酸克隆序列与核苷酸克隆序列,发现同一志愿者中,接种疫苗后与接种疫苗前相比高频克隆序列的大部分频率发生变化,并且不同志愿者之间的序列不同;此外还了解高频序列和对应多肽的性质,如等电点和平均亲水性。结论通过高通量测序对狂犬病病毒疫苗免疫后的人BCR进行了定量分析,发现了狂犬病疫苗免疫人后BCR表达谱的变化情况,为了解B细胞在保护宿主免受RABV感染和改善疫苗反应的生物学作用提供实验性数据。     

狂犬病疫苗免疫人B细胞受体库的高通量测序分析

目的对志愿者接种商业化狂犬病病毒疫苗前后的B细胞受体库进行高通量测序,探讨志愿者接种前后B细胞受体库互补决定区3表达谱的变化情况,为了解B细胞生物学作用、评估疫苗作用等提供参考。方法以商业化狂犬病病毒疫苗分别注射4个志愿者,分离外周血单核细胞,提取PBMC总RNA,对总RNA进行逆转录获得cDNA,以cDNA为模板进行多重PCR,后通过Illumina HiseqtmXten(novaseq)平台进行高通量测序和生物信息学分析。结果通过接种RABV疫苗,志愿者BCR的多样性改变但变化无统计学意义。V/J区基因片段的序列使用频率以及V-J基因组合改变,其中IGHJ1基因与IGHV1-3、IGHV3-20、IGVH3-7和IGHV2-26使用频率升高,免疫前后差异有统计学意义;8个V-J组合在免疫前后差异有统计学意义。鉴定了疫苗免疫诱导B细胞克隆后高频扩增(0.4%)的CDR3氨基酸克隆序列与核苷酸克隆序列,发现同一志愿者中,接种疫苗后与接种疫苗前相比高频克隆序列的大部分频率发生变化,并且不同志愿者之间的序列不同;此外还了解高频序列和对应多肽的性质,如等电点和平均亲水性。结论通过高通量测序对狂犬病病毒疫苗免疫后的人BCR进行了定量分析,发现了狂犬病疫苗免疫人后BCR表达谱的变化情况,为了解B细胞在保护宿主免受RABV感染和改善疫苗反应的生物学作用提供实验性数据。     

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）登录GenBank；对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序，获得149个EST，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA，大部分为管家基因，其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果获得了1个日本血吸虫新基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子质量为7．2198ku，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆人硫氧还蛋白(human thioredoxin，hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法 ①应用RT-PCR技术以成人睾丸组织RNA为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因。②应用PCR技术以人的睾丸组织cDNA文库为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因。二者分别克隆至pGEM-T Easy载体中进行基因序列测定。结果 将所得序列与EMBL Data-Library X54539提供的序列比较，其可译框架相同。将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较，酶活性位点(Trp-Cys-Pro-cys)与其相同，第117、222位碱基与其不同，编码的氨基酸也发生了变化。结论 从睾丸组织或基因文库中克隆均获得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因，为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定基础。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。　方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。　结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 ,全长 14 3 9bp ,编码 44 3个氨基酸 ,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有 79%的同源性。编码蛋白的理论分子质量为 7.2 198ku ,等电点为 9.12 ;抗原表位可能位于cDNA序列 3 73～ 3 96处。　结论　表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

风湿病与疫苗接种

疫苗已经成为人类战胜多种致命性传染病的廉价、高效武器.但也观察到一些人会在接种疫苗后出现一些自身免疫病的临床表现.接种疫苗后是否会引起自身免疫病一直是人们不断探讨的课题.虽然这些疾病的表现在发生时间上与疫苗关系密切,但目前尚无疫苗引起自身免疫病的直接证据,目前比较一致的观点是疫苗与这些自身免疫病具有一定的相关性.现就疫苗与风湿性疾病的关系及研究现状综述如下.     

布鲁氏菌病新型疫苗研究进展北大核心CSCD

布鲁氏菌病(简称布病)是一种严重危害人类及动物健康的人兽共患传染性疾病,接种疫苗是控制布病流行的有效手段之一,而目前还没有获得许可的疫苗来预防人类布病,兽用疫苗存在毒力恢复及不能区分疫苗接种与野菌株感染的不足。随着基因工程、分子克隆等技术的日益发展,重组蛋白疫苗、DNA疫苗、纳米颗粒疫苗、载体疫苗等新型疫苗相关研究逐渐成为布病疫苗领域的研究热点。本文就近十年出现的新型布病疫苗研究进展情况作一综述,以期为开发更为有效、安全的布鲁氏菌病新型疫苗提供新的思路。     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

运用生物信息技术分析日本血吸虫Z88基因cDNA序列

目的通过基因序列分析，寻找日本血吸虫新的基因，为日本血吸虫病防治筛选新的候选疫苗抗原。方法从已构建的日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取已知克隆(克隆号为Z88)，测定其全长cDNA序列后，再运用生物信息学方法以及相关软件对此基因进行分析。结果通过测定以及分析可知此基因的cDNA序列为1303bp，编码349个氨基酸，为DnaJ-相似蛋白，与果蝇、鲐、人及鼠的DnaJ-相似蛋白有一定同源性。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论Z88基因为日本血吸虫DnaJ-相似蛋白基因，可能参与蛋白折叠、装配和运输等功能。     

日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选

目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。     

日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析

目的 对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法 根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板，采用套式PCR，快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5’、3’末端片段，将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5’、3’末端片段序列进行比对和拼接，构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列，对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果 本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段，其中16个片段的5’、3’末端cDNA序列被成功扩增，并测定了它们的DNA序列，通过序列比对和拼接，获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析，发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同，而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似，从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明，基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接（alternative splicing）方式进行拼接；而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论 确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列，虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。     

经典的病毒性发疹病的变迁

麻疹:由于疫苗的接种,目前出现了以下的变化:(1)成年人麻疹发病率增高,在诊断中容易与立克次体病和虫媒病毒引起的疾病混淆。(2)在曾接种过麻疹疫苗的人群中,由于继发免疫失败后发生的麻疹,轻型病例较多,前驱期短,症状、体征不典型,临床表现与风疹及其它一些病毒性发疹病相似,又多为散发病例,临床诊断有时困难。(3)非典型麻疹,是在一些曾接种过灭活麻疹疫苗的人群中,当再     

日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白的基因克隆与序列分析

本研究根据曼氏血吸虫疫苗候选分子Sm23的基因序列，设计了一对引物，并通过聚合酶链反应（PCR）基因克隆技术，从日本血吸虫中国大陆株cDNA文库中克隆出了中国大陆株23kDa膜蛋白基因。DNA序列分析表明，编码日本血吸虫中国大陆株Sj23膜蛋白的基因含有657bp，与曼氏血吸虫Sm23的核着酸有79．5％的同源性，而与日本血吸虫菲律宾株的Sj23的同源性为100％。该研究为发展Sj23多肽疫苗奠定了基础。     

老年人群接种23价肺炎球菌疫苗的不良反应观察

老年人群是肺炎球菌感染的高危人群，在老年人群中接种肺炎球菌疫苗是一条有效而经济的预防途径。1988年，世界卫生组织(WHO)就竭力推荐在全球老年人群中接种23价肺炎球菌疫苗。但我国该疫苗的接种令人十分不满意。为提高国内对其安全性的认识，我们观察了2002年11～12月315人老年人接种23价肺炎球菌疫苗后不良反应，现报道如下。     

用噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白基因结合蛋白的研究

目的筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白（CagA）基因结合蛋白，探索CagA致病机理。方法应用噬菌体展示技术，以幽门螺杆菌CagA基因片段作为固相筛选分子，对噬菌体人胃细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集，噬斑裂解液PCR扩增后，进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索，确定编码结合蛋白的种类。结果噬菌体经富集后，筛选出36个阳性克隆，构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定幽门螺杆菌CagA基因共编码核纤层蛋白B1和胰岛素样生长因子结合蛋白2两种已知蛋白。结论用噬菌体人胃cDNA文库筛选得到幽门螺杆菌CagA基因DNA结合蛋白，为研究CagA致病机理，幽门螺杆菌疫苗的研制和治疗等提供依据。     

乌鲁木齐县麻类疫苗接种时间序列模型建立及应用

目的探讨新疆乌鲁木齐县麻类疫苗接种的时间趋势,为疫苗分配管理提供参考依据。方法采用Spss 21.0软件进行统计学分析,用时间序列分析方法进行季节分解和模型建立,检验水准α=0.05,P0.05时认为模型无效。结果2009─2014年乌鲁木齐县麻类疫苗第一剂次与年份呈负相关(r=-0.317,P0.05);第二剂次与年份呈正相关(r=0.057,P0.05);本次研究经过多次拟合后,确定麻类疫苗第一剂次和第二剂次的时间序列模型均符合指数平滑模型,第一剂次[R~2=0.768,Ljung-Box(18)=12.537,P0.05]和第二剂次时间序列模型[R~2=0.786,Ljung-Box(18)=22.178,P0.05]皆有效;麻类疫苗第一剂次与第二剂次均满足2─5月随接种数量逐渐上升,在5月出现接种高峰的需求;第一剂次在每年3月、第二剂次每年10月出现接种低谷。结论乌鲁木齐县麻类疫苗接种数量有一定的变化规律,基本符合指数平滑模型的要求,建立模型预测每月的接种数量比较可靠,后期制定疫苗使用计划中可考虑应用。     

cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端延伸快速分离全长cDNA序列

建立一种cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端快速扩增分离人类新基因全长cDNA序列的新技术。以文库载体序列与待扩增目的基因片段为模板各设计引物进行热启动聚合酶链反应扩增，从人胎肝cDNA文库中获得氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化过程中差异表达序列标签片段（FRG4）的全长cDNA序列，聚合酶链反应产物克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，从而成功获得FRG4的全长cDNA序列，该技术是一种快速有效的分离人类新基因全长cDNA序列的方法。