针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

miR-122表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

目的构建miR-122表达载体并检测其表达对HepG2.2.15细胞恶性表型的逆转作用。方法以HepG2.2.15细胞基因组DNA为模板,PCR扩增miR-122前体cDNA序列,以质粒pSilencer3.1-H1 neo为母本,构建miR-122表达载体将其转染HepG2.2.15细胞。表达后,利用ELISA检测HepG2.2.15细胞HBV复制和表达的变化,利用CCK8检测细胞增殖的变化。结果构建的miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中表达。转染后HepG2.2.15细胞中HBV复制、表达以及细胞增殖均被抑制。结论 miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中有效表达,其表达可抑制HBV复制、表达以及细胞增殖。     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。     

HepG2.2.15细胞的差异性表达及对IFN-α的反应性研究

采用有限稀释法从HepG2.2.15细胞株中分离出10株单克隆细胞株.ELISA法检测其HBsAg与HBeAg表达量,根据HBsAg、HBeAg表达量的不同,筛选出最高、中等、最低3株克隆细胞株.MTT法进行干扰素(IFN)-α的细胞毒作用研究,表明IFN-α对不同克隆细胞株药物毒作用相似.ELISA法检测各克隆细胞株给IFN-α前后HBsAg、HBeAg表达量,IFN-α对HepG2.2.15细胞HBeAg的抑制作用较弱,对HBsAg、HBV DNA的抑制作用较强,且对表达量高的克隆细胞株抑制作用更强.不同HepG2.2.15细胞表达HBsAg与HBeAg存在差异性,且表达量高的细胞株对治疗浓度的IFN-α更加敏感.     

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。     

抗HBV反义寡核苷酸的筛选

目的 筛选出对HBV有抑制作用的反义寡核苷酸(AS-ONs),为HBV的预防和治疗提供基础.方法 合成5条与HBV互补的反义寡核苷酸,转染HepG2.2.15细胞,运用荧光定量PCR和酶联免疫法测定反义寡核昔酸对细胞培养液中HBVDNA和HBsAg、HBeAg的抑制作用.结果 寡核苷酸序列Ⅰ(TAC CTC TYG T...     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

复方虎杖方体内外抗乙肝病毒的活性评价

目的 研究复方虎杖方体内外抗乙肝病毒作用.方法 体外实验采用CCK-8染色法检测复方虎杖方水提物、醇提物对HepG2.2.15细胞株的抗增殖活性,采用化学发光微粒子免疫检测法测定HBsAg、HBeAg含量,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA含量;体内实验采用血清斑点杂交法(Dot blot)测定给药5、10 d...