黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达及重组酶性质

以黑曲霉（Aspergillus niger）高耐热葡聚糖酶编码基因eglA6在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中的表达及重组酶性质为研究目的。利用乳酸克鲁维酵母表达系统,构建表达eglA6基因的重组菌K. Lactis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105,重组菌摇瓶发酵酶活达到23.0 U/mL。重组酶AnEglA6K表观相对分子质量为5.6×10⁴,明显高于同一基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物。重组酶最适pH为5.0,最适温度为75 ℃,在80 ℃时酶活半衰期为65.0 min。以微晶纤维素为底物时重组酶比酶活约为0.5 U/mg。基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达产物与其在巴斯德毕赤酵母中的表达产物有明显差异,前者相对分子质量明显高于后者,热稳定性和结晶纤维素降解活性也高于后者。以乳酸克鲁维酵母为宿主表达eglA6基因获得的重组葡聚糖酶具有很高的耐热性,适合在饲料工业中应用。     

β-1,3葡聚糖酶高产菌株的筛选及其产酶条件研究

从土壤中分离筛选出一株β-1，3葡聚糖酶活较高的菌株，编号为M014，初步鉴定为木霉。研究了碳源、氮源、培养温度与时间等因素对M014产酶的影响。实验结果表明，MOl4在含3％茯苓粉、0．5％酵母膏及一些无机盐的液体培养基中(pH6．0)，于30℃，150r／min振摇培养6d，β-1，3葡聚糖酶活最高，达到4．95U／ml。另外，还就β-1,3葡聚糖酶的酶解条件进行了研究，结果显示，β-1,3葡聚糖酶的最适反应pH为4．5,最适反应温度为60℃.粗酶液在40℃和50℃保温12h，酶活基本稳定，最适反应温度为60℃保温时，酶活迅速下降。     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

响应曲面法优化酵母β-葡聚糖酶解工艺及产物分析

采用β-葡聚糖酶对酵母β-葡聚糖进行酶解,利用单因素和响应面实验,以水溶性酵母β-葡聚糖得率为指标优化酶解工艺,并对水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的结构和热稳定性进行了研究。最佳酶解条件:底物质量浓度1.14 g/100 mL,酶活浓度0.16 U/mL,温度44℃,pH 4.2,水溶性酵母β-葡聚糖得率为39.89%。红外光谱分析结果表明,水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的糖苷键型均为β构型,分子构象相同。热稳定性分析表明,水溶性酵母β-葡聚糖和原酵母β-葡聚糖的特征分解温度分别为356℃和360℃,终止分解温度分别为740℃和780℃,热稳定性差异不大。     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

小麦麸皮内源性β-木糖苷酶酶活测定及酶学性质

以PNP-β-xylopyranoside为底物确定小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶活力测定条件,并对β-木糖苷酶的酶学性质进行研究。试验确定酶活测定条件为底物浓度1mg/mL,提取液pH 5。木糖苷酶的酶学性质:最适反应温度为60℃,在20~50℃时稳定性好,保温60min后其活力可保持在70%以上,最适pH值为5,在pH值5~6时对木糖苷酶的破坏力相对较小,保温60 min后其活力仍可保持在80%以上。动力学参数Km和Vmax分别为4.518mg/mL,0.392μmol/(min·g)。通过对4种小麦麸皮酶活力进行测定发现:细麸中的β-木糖苷酶活性均高于粗麸,粗麸中郑麦8998的木糖苷酶酶活最大,细麸中花培8号小麦木糖苷酶活性最大。     

球毛壳菌α-葡聚糖酶的异源表达、纯化及特性表征

利用毕赤酵母密码子偏好性优化合成球毛壳菌α-葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。通过高拷贝筛选和摇瓶发酵条件的单因素优化,重组α-葡聚糖酶的酶活力由初始的2.692 U/mL提高至47.915 U/mL。选择 Hitrap Q HP 和Hitrap SP HP 的双步层析分离将发酵粗酶液纯化至电泳纯,纯化倍数40.83,比活达277.61 U/mg,回收率为24.15%。纯酶最适温度和pH分别为60 ℃和5.5。在20~50 ℃和pH为4.5~8.5范围内稳定性良好,浓度为10 mmol/L的Fe²⁺对酶有激活作用,Cu²⁺浓度（0.1~10 mmol/L）越高对酶的抑制作用越强。酶动力学实验发现该重组酶对高相对分子质量的底物亲和力更高,葡聚糖T2000为该酶的最适底物。     

樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

从嗜热真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)中克隆α-淀粉酶基因McAmyA,并在毕赤酵母GS115中高效表达,经高密度发酵至168 h时,胞外酶活力达到13 440. 6 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经QSFF强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶,比酶活力为1 230. 2 U/mg。酶学性质研究表明,重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别是6. 5和65℃。以淀粉液化液为底物,在温度60℃,加酶量120 U/g,水解24 h的条件下,重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液,制备得到麦芽糖含量为50. 0%(质量分数)的麦芽糖浆。该真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达水平高,具有很大的应用潜力。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。 重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

酶解法增溶酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的研究

以实验室制备的酵母(1→3)-β-D-葡聚糖为原料,通过酶解法制备水溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖,并对其结构和生物活性进行了研究。以水溶性酵母葡聚糖得率为指标,通过单因素和正交实验,确定了酵母(1→3)-β-D-葡聚糖酶解的工艺条件。优化后的酶解条件为:酶活浓度0.15 U/mL,底物质量浓度0.5 g/100 mL,酶解温度40℃,pH3.5,酶解时间0.5 h,该酶解条件下水溶性酵母葡聚糖得率为80.3%。红外光谱分析表明,水溶性葡聚糖仍具有(1→3)-β-D-葡聚糖分子构型,刚果红实验表明其具有三螺旋结构。活性实验表明,水溶性葡聚糖能有效提高E.coli诱导的患腹膜炎小鼠的存活率。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

K.paraultunense角蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

将角蛋白降解菌Keratinibaculum paraultunense(K.paraultunense)所产角蛋白酶的粗酶液,依次通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose-FF阴离子交换以及Superdex 75凝胶色谱层析等分离纯化,最终得到一种电泳纯的角蛋白酶。其纯化倍数为14.55,回收率为7.24%。SDS-PAGE分析结果表明该酶的相对分子质量约为29 KDa。酶学性质研究表明,该酶最适作用温度为80℃;最适pH为7.5,在pH 6.0～9.0范围内酶活力较为稳定;当以酪蛋白为底物时,该酶的动力学常数Km为4.37 mg·mL~(-1),Vm为14 556 U·(mg·min)~(-1),而当以羊毛角蛋白为底物时,该酶的动力学常数Km为15.66 mg·mL~(-1),Vm为2610 U·(mg·min)~(-1);Ca~(2+)对酶活有明显的促进作用,但苯基甲基磺酰氟(PMSF)对酶活有较强的抑制作用。     

不同温度、pH值对β-葡聚糖酶活力的影响研究

采用DNS比色法测定不同温度和pH值对β-葡聚糖酶活力的影响,研究结果表明,β-葡聚糖酶最适反应温度为50℃,最适pH值为4.8。在pH2.0和pH 8.0的缓冲液中浸泡4h后,酶活分别保留了73%和64%。说明β-葡聚糖酶能够耐受较强的酸碱性环境。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70％的（NH4）2S04及DEAE--琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28．7倍,酶回收率为45．2％。经SDS--PAGE分析,该酶分子量近似54．6KD。酶最适反应pH为5．0,最适温度为50℃。在pH3．0-5．0、温度30℃-70℃之间酶活相对稳定。Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋以及Cu2＋对该酶有抑制作用,Zn2＋、Ca2和Fe2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。以上表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

胆固醇氧化酶的发酵条件及酶学性质研究

Brevibacterium sp．可以发酵生产胆固醇氧化酶,实验中对该菌种进行了底物诱导及发酵条件的优化, 确定其最适培养基为(%)：蔗糖0．3,酵母膏0．2,蛋白胨0．3,牛内膏0．3,K_2PO_4 0．1,MgSO_4 0．05,pH6．8。最适培养条件为：接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL 培养基/250mL 三角瓶,200r/min。在最适培养基及最适条件下,胆固醇氧化酶的酶活力可达到24．01U/mg,比未优化前1．71U/mg 提高了14倍。该酶具有较强的酸碱稳定性和热稳定性,最适 pH 为6．5,最适温度为54℃。在最适 pH 和温度条件下测得该酶 km 值为7．1 ×10~(-5)mol/L。     

纤维微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表达及对灵芝细胞壁的水解作用

该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因，该基因命名为bgl6906并与表达载体连接，构建重组质粒pET28a-bgl6906,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906。重组菌在TB培养基中进行诱导表达，表达产物在自身信号肽引导下大部分分泌到细胞外。以茯苓多糖为底物时，重组酶BGL6906纯酶比酶活力为567.8 U/mg,最适pH为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h胞外酶活力达到67 U/mL。重组酶BGL6906与果胶酶交替水解灵芝菌丝体培养物，可以有效水解细胞壁，获得部分原生质体。进一步辅助短时超声波破碎可以大幅度提高灵芝胞内产物的释放。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到1株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9.其发酵条件及酶学特性为:发酵 72h,在pH6.0、70℃条件下,酶活性为82.64u/mL.分子生物学及其生理生化鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).W-9产β-葡聚糖酶的酶学性质结果显示,其产β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,在70℃条件下保温时,酶活基本稳定.     

串珠镰孢菌来源的角质酶基因的克隆表达及其酶学性质

克隆一个来源于串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme Sheld)的角质酶基因,该基因全长693 bp,编码231个成熟的氨基酸。克隆的角质酶基因构建到pPIC9K质粒,获得重组表达载体,转入毕赤酵母(Pichia pastoris Gs115)中进行高效表达。经甲醇诱导96 h,测得重组酶酶活为71.68 U/mL,经纯化获得比活力为2490.1 U/mg。对纯化后的角质酶进行酶学性质分析结果表明,其最适反应pH为9.0,在pH5.0~9.0范围内之间重组角质酶的酶活相对稳定;最适反应温度为35 ℃,在40 ℃条件下保温1 h酶活力保持70%以上。KCl、Triton X-100、MnCl₂、SDS对该酶活有促进作用,NaCl、BaCl₂、CuSO₄、Tween-20、FeSO₄、ZnSO₄、NiCl₂、EDTA、Tween-80对该酶活有抑制作用。