人信号传导及转录激活因子shRNA载体的构建与鉴定

目的：构建针对人信号传导及转录激活因子1（STAT1）基因的shRNA表达载体,检测其对STAT1基因的沉默效果。方法设计针对STAT1的shRNA序列,克隆到pGPU6质粒载体,并进行测序、转染和鉴定。结果 DNA测序显示成功构建了4个shRNA表达载体。shRNA能有效抑制STAT1基因在人宫颈癌细胞株TZM- bl细胞中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了针对人STAT1基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo- shRNA STAT1。     

针对乙酰肝素酶基因的短发夹RNA干扰载体的构建

目的 构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹RNA(ahRNA)表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒...     

细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定

目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制因子3(SOCS-3)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,选取最有效shRNA模板序列。方法设计并合成编码的shRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定;转染至骨骼肌细胞中。Real-time PCR和Western blot检测各组SOCS-3的表达情况。结果测序证实重组质粒构建成功。4对shRNA模板序列对SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比差异均有统计学意义(均P<0.05),且以SOCS-3-shRNA a干预效果较好。结论 SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌细胞SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础。     

人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2 基因shRNA载体的鉴定和表达

目的构建针对人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体,转染SH-SY5Y细胞株,观测其对AMPKα2基因的沉默效果。方法利用Ambion在线设计软件设计针对人AMPKα2基因的shRNA干扰序列,克隆到pGPU6/GFP/Neo质粒载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用质脂体将重组质粒转导SH-SY5Y细胞株,经G418筛选阳性克隆后用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达水平。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,4个shRNA表达载体构建成功。4个重组质粒之一的pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了针对人AMPKα2基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2。pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,为将来应用其研究AMPK在细胞损伤中的作用奠定了基础。     

Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的：构建Smad4基因小发夹RNA（shRNA）表达载体。方法：设计、合成3对编码Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，并分别将其克隆人pGCsi—H1／Neo／GFP质粒，酶切、测序鉴定，脂质体法转染293细胞。实时荧光定量PCR检测RNA干扰（RNAi）的抑制效果。结果：在经Hindm和BamHⅠ双酶切分别鉴定三种重组载体后，DNA测序证实小干扰RNA（siRNA）序列正确，并被准确克隆人载体。实时荧光定量PCR检测结果表明三种重组载体psiSmad4—1、psiSmad4—2和psiSmad4—3载体，分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39．00％、8．80％和73．80％。结论：成功构建Smad4pGCsi—H1／Neo／GFP／shRNA质粒，为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。     

编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础.方法:将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌.将pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定.结果:结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明Adeno-U6-shRNA包被成功.结论:成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体Adeno-U6-shRNA,将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

乙酰肝素酶基因靶向特异性RNA干扰重组表达载体的构建及筛选

目的 构建对人乙酰肝素酶(HPA)基因有特异性抑制作用的短发夹状RNA表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的人HPA基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染人MDA-MB-231细胞,分别以荧光定量PCR、Western blot分析其对HPA在mRNA水平和蛋白质水平上表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.在构建的5个载体中,HPSE-1组及HPSE-5组中MDA-MB-231细胞HPA基因mRNA和蛋白质表达水平明显下降,而对照组未发生明显改变.结论 成功构建了2个靶向人HPA的shRNA表达载体,转染MDA-MB-231细胞后可高效抑制HPA基因表达,为进一步研究HPA的表达与乳腺癌迁移和侵袭的机制奠定了基础.     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

GPR40 shRNA表达载体构建及其稳定转染βTC6细胞系的建立

目的构建G蛋白偶联受体40（Gprotein coupled receptor 40,GPR40）shRNA表达载体质粒,获得干扰质粒稳定转染的小鼠βTC6细胞系。方法将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pSilencer4.1-CMVneo表达载体,并测序鉴定。脂质体法把重组质粒转染至βTC6细胞,通过G418筛选建立稳定转染的βTC6细胞系,采用蛋白印迹（Western blotting）技术检测GPR40蛋白表达。结果构建了GPR40 shRNA重组真核表达载体,并成功地下调了βTC6细胞的GPR40表达。结论成功构建了GPR40 shRNA真核表达载体,获得稳定表达GPR40 shRNA的βTC6细胞系。     

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

ＰＩ３-Ｋ／Ａｋｔ ｓｈＲＮＡ真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对P13-K/Akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体.方法:用DNA重组技术将针对大P13-K/Akt基因不同位点所设计的8个shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中.在酶切分析及序列测定后,用脂质体染至大鼠肾小球系膜细胞(GMCs).Western blot检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及酸序列分析证明重组质粒正确.Western blot证实在重组质粒中shPik3c3-2、shAktl-4具有最佳沉默效率.结论:成功构建了PK/Akt shRNA的真核表达质粒.该实验结果为进一步研究P13-K/Akt信号通路的生物学功能奠定了基础.