双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用

目的 观察携带反义凝血酶受体(ATR)和p21的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用，为再狭窄基因治疗寻求新途径。方法 以携带ATR或/和p21的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)，用半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达，MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率。将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉，免疫组织化学法分别检测凝血酶受体(TR)和p21两基因在动脉壁中的表达。结果 RT-PCR结果显示，TR单基因的mRNA表达降低，p2l单基因表达升高，AP双基因得到了共表达；MTT法测定的生长曲线显示，双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因；免疫组织化学证实，AP双基因导入后，TR基因的表达受到完全抑制，p2l基因的表达明显增加，血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制。结论 ATR和p21双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖，在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生。     

NK4基因在人胰腺癌细胞中的表达及其对血管内皮生长的影响

目的:构建NK4基因真核表达载体并进行转染研究。方法:对重组质粒pcDNA3/hNK4进行酶切,将目的基因NK4克隆到较强的真核表达载体pRC/CMV2中,应用脂质体将NK4基因转染到胰腺癌细胞株SW1990中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用RT-PCR及Western blot鉴定及筛选出高转录和高表达的细胞克隆。以MTT法检测转染重组质粒pRC/CMV2-hNK4的细胞克隆表达产物对血管内皮细胞生长的影响。结果:在转染NK4基因的SW1990细胞克隆中,RT-PCR能扩增出NK4 mRNA预期的453bp片段,但强弱不同,Western blot显示均有约50 kD的NK4蛋白的表达。其上清可显著抑制血管内皮细胞的生长。结论:重组质粒pRC／CMV2-hNK4是一种高效真核表达载体,并且能够在SW1990细胞中高表达;NK4能够抑制血管内皮细胞的生长,提示其在肿瘤基因治疗中可能具有重要意义。     

TGFβl基因对血管平滑肌细胞弹性蛋白表达及与基质黏附力的影响研究

了解TGFβ1基因对血管平滑肌细胞弹性蛋白表达及与基质黏附力的影响。用DOTAP脂质体转染pMAMneoTGFβ1于原代培养的血管平滑肌细胞，经G418筛选，TGFβ1表达经免疫荧光鉴定。原位杂交确定弹性蛋白的表达，微管吸吮系统确定平滑肌细胞与基质的黏附力。结果表明生理情况下的平滑肌细胞能表达少量的TGFβ1及少量的原弹性蛋白。经G418筛选，外源性TGFβ1在血管平滑肌细胞中稳定表达，能显著提高2～3倍原弹性蛋白的表达及细胞与基质的黏附力。说明TGFβ1且在血管组织工程中具有重要的应用价值。     

HESR1基因在血管新生中作用的初步研究

目的研究转录因子HESR1在血管新生中的作用。方法检测内皮细胞激活状态HESR1表达的影响,克隆HESR1基因,转染到HUVEC,绿色荧光和PCR观察HESR1在内皮细胞的表达,流式细胞仪检测它对血管内皮细胞增殖,boyden小室检测对细胞迁移的影响,建体外二维血管模型,观察HESR1对血管形成的影响。结果内皮细胞激活状态HESR1的表达下降,HESR1基因能抑制内皮细胞的增殖和迁移,减少血管新生。结论HESR1基因通过抑制内皮细胞的增殖和迁移,使内皮细胞从激活状态转入安静状态,减少血管的形成,维持血管的稳定状态。     

血管内皮细胞生长因子受体2作为恶性血管源性肿瘤和间皮瘤的标记:262例血管内皮源性及1640例非血管源性肿瘤免疫组化研究

血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是KDR基因编码的、主要表达于血管内皮细胞的Ⅴ型酪氨酸激酶受体,对VEGF通路信号起反应并调节内皮细胞的迁移和增殖。VEFGR2主要表达于肿瘤新生血管的内皮细胞及血管源性肿瘤,也有大量表达于乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌及尿路     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

原发性高血压相关基因的研究进展

原发性高血压是一种由遗传因素和环境条件共同决定的复杂的多基因病。此病相关基因的结构和表达异常可导致高血压，因此它的研究一直受到人们的重视，本就近年来该研究领域的一些进展做一综述。     

VEGF与肿瘤血管生成及抗血管生成基因治疗

ＶＥＧＦ是一种重要的血管生成因子，已发现许多生长因子如ＥＧＦ，ＰＤＧＦＢＢ，ｂＦＧＦ，ＴＧＦβ等都是通过诱导ＶＥＧＦ的表达而起作用的。ＶＥＧＦ 可改变内皮细胞基因的活化形式，增强血管通透性，诱导血管生成。目前抗血管生成基因治疗是肿瘤治疗研究的热点，大多数肿瘤表达高水平ＶＥＧＦ，且其表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。     

内皮型一氧化氮合酶基因多态性与原发性高血压

原发性高血压是我国发病率最高的心血管疾病，是一种多基因，多因子病。一氧化氮是重要的内皮衍化的舒张因子，很多生理性的以及药物引起的血管舒张都是通过一氧化氮途径实现的。但内皮型一氧化氮合酶基因的突变与原发性高血压的关系仍有待明确。     

联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响，探索一种理想的血管再狭窄的疗法。方法：选择20只新西兰家兔，实验组、对照组各10只，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，实验组行腺病毒介导的p21 cDNA溶液浸泡和反义c-fos寡聚核苷酸凝胶涂布；对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度（IT）、内膜平滑肌细胞（VSMC）数及PCNA阳性表达情况。结果：实验组移植血管IT、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少，增殖细胞核抗原（PCNA）阳性表达情况亦较对照组明显减少。结论：联合转染p21基因和反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生。     

生物化学和分子生物学

一种新的垂体分泌蛋白Mimecan原核表达、抗体制备及其在垂体瘤组织中的表达；人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析；重组人内皮抑素的结构改造及抗肿瘤活性变化；一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究；人可溶性APRIL基因的克隆、表达及生物学活性检测；P53与TRF1、TRF2的体外结合及P53结合功能区的分析；人成纤维细胞转录因子Sp1／Sp3对p16^INK4a基因的调控；血管舒-缩肽在血管平滑肌细胞中的表达与调控；rhsBLyS及其突变体对小鼠血清免疫球蛋白分泌及B细胞增殖分化的影响；小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖；抑制消减杂交分离肿瘤血管生成相关基因；鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对前列腺癌细胞生长的抑制作用；达菲抗原趋化因子受体在不同转移性人乳腺癌细胞中的差异表达；Ezrin在肝癌中的表达及其与肿瘤黏附、侵袭和门静脉癌栓的关系；丙丁酚抑制氧化型低密度脂蛋白诱导系膜细胞转化生长因子-β1表达；雌孕激素对SMMC-7721人肝癌细胞α-1，6岩藻糖基转移酶的调控；多西他赛对结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用；PTH作用于老年大鼠骨髓细胞骨代谢相关基因表达的实验方法；新转移相关蛋白SNC19翻译后加工及其活性形式的研究；大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与y干扰紊融合蛋白真核表达载体的构建；小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布；阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用；抗HIV-1 gp120人源mAb重链CDR区分子特性分析；基于斑点免疫金渗滤法的蛋白微矩阵；人肝癌组织中转醛醇酶活性高表达；人IFN-β基因脂质体转染胶质瘤细胞对凋亡的诱导作用；Survivin在2株人脑胶质瘤细胞系中的表达；瘦素受体基因多态性与2型糖尿病的关系及其对血脂的影响。     

血管紧张素转换酶2基因转染对人内皮细胞MIF表达的影响

目的：探讨重组血管紧张素转换酶2（ACE2）基因转染对体外培养的人血管内皮细胞中由血管紧张素（Ang）II诱导的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的影响。方法:克隆和构建含人ACE2基因全长的重组质粒（pACE2），并将之转染入人血管内皮细胞中。分别采用实时定量PCR和Western印迹技术检测转染细胞中的MIF mRNA与蛋白表达情况。结果: Ang Ⅱ（100 nmol/L）和Ang IV（100 nmol/L）刺激后均可诱导人血管内皮细胞中MIF mRNA及蛋白表达增加（P<0.01）。pACE2基因转染可明显抑制内皮细胞中由Ang II和Ang IV诱导的MIF mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: ACE2基因过表达可明显抑制人内皮细胞中炎症介质MIF的表达，提示ACE2基因具有一定的抗炎症效应。通过调节ACE2基因的活性和表达，很可能为炎症相关疾病如动脉粥样硬化治疗提供新的策略。     

雌激素受体在大鼠血管平滑肌细胞中的表达及其调控

目的：观察血管平滑肌细胞(VSMC)中雌激素受体(ER)的表达，研究雌激素和血清(含多种生长因子)对细胞中：ER表达的影响。方法：原位杂交和RT-PCR检测大鼠主动脉中层VSMC中的ERmRNA。分别在有或无他莫昔芬(TAM)(ER拮抗剂)预处理的情况下，免疫细胞化学观察VSMC中的ER蛋白，比较雌二醇(E2)以及新生小牛血清(NCS)对VSMC中ER表达的影响。结果：VSMC中存在ERmRNA和蛋白，E2以及NCS均能上调细胞中ER的表达，TAM能阻断其效应。结论：ER是雌激素作用于VSMC的靶基因之一。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

DJ-1基因与帕金森氏病的研究进展

[摘要] 帕金森氏病是目前世界上最常见的神经系统退行性病变之一，DJ-1是一个与帕金森氏病相关的基因，其致病的作用机制不完全清楚。很多研究人员对DJ-1的蛋白功能进行了研究，目前已经发现DJ-1蛋白具有抗氧化、调节转录、参与能量代谢、抑制细胞凋亡等作用，本文总结了DJ-1的结构、突变形式、生物学作用与帕金森病发生的关系，以及DJ-1基因与其它导致帕金森氏病的基因之间的相互作用。对研究和了解帕金森氏病及其基因治疗具有重要意义。     

治疗阿尔茨海默氏病的胆碱酯酶抑制剂研究进展

阿尔茨海默氏病（AD）是一种以记忆力和认知功能障碍为主要特征的渐进性神经退行性疾病。由于其发病机制复杂，发病原因尚不清楚，至今尚无好的根治或逆转的药物。胆碱能假说的提出第一次为阿尔茨海默氏病的治疗提供了一种合理的策略。在各种提高胆碱能传递功能的治疗方案中，胆碱酯抑制剂是现今研究最多也是最成功的一类能增强胆碱能功能从而改善患症状的药物。     

基因重排分析与p53的表达在判定血管免疫母细胞性淋巴结病性质上的意义

目的探讨基因重排和p53表达在判定血管免疫母细胞性淋巴结病(AIL)的病变性质上的意义。方法运用聚合酶链反应(PCR)技术检测44份AIL石蜡包埋组织标本中IgH及TCRγ基因重排情况,采用免疫组织化学ABC法染色技术检测AIL免疫表型及p53蛋白表达。并对35例进行了随访。结果44份AIL标本中,12份（27.3%）检测出TCRγ基因重排,2份（4.5%）IgH基因重排,2份（4.5%）IgH与TCRγ基因双重排。14份AILp53蛋白表达阳性,其中12份为IgH或TCRγ基因重排阳性。基因重排阳性组与阴性组对比,p53蛋白表达差异有非常显著性意义(P<0.01)。11例基因重排阳性患者中8例1年内死亡,随访至18个月时3例存活;24例基因重排阴性患者中,仅3例1年内死亡,余21例随访时仍存活,最长达96个月。结论AIL是一种临床病理综合征;基因重排能准确地判定其病变性质;p53蛋白表达与AIL基因重排有关,是判定AIL病变性质的重要免疫学指标。     

rhbFGF基因及其蛋白促兔缺血心肌血管新生的对比研究

目的 探讨通过心肌内注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)基因及其蛋白促兔缺血心肌血管新生的“基因血管搭桥”的效果。方法 无菌条件下开胸结扎兔冠状动脉左前降支(LAD)，建立急性心肌梗死动物模型。将成功构建的真核表达质粒pcDNA3-bFGF、rhbFGF蛋白、生理盐水，直接四点注射人兔缺血心肌内。实验兔饲养6周、12周以后，通过病理切片光镜观察、图像分析对比研究三组间血管新生情况。结果 1)成功构建pcDNA3-bFGF真核表达质粒并制备rhbFGF蛋白；(2)pcDNA3-bFCF真核表达质粒在心肌中成功表达为rhbFGF蛋白；(3)血管新生的观察：通过对心肌内注射基因及其蛋白进行对比研究，发现心肌内注射蛋白和基因均有促兔缺血心肌血管新生的作用，而基因的促血管新生作用更强。结论 rhbFGF蛋白及基因心肌内注射均有促兔缺血心肌血管新生的作用，而基因的促血管新生效果显著。“基因治疗促血管新生”法是另一种有效的冠心病治疗方法，rhbFGF基因有重要的推广应用价值。     

AT2R基因在体转染抑制大鼠颈动脉新生内膜增生

目的: 探讨AngⅡ 2型受体（AT2R）基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的抑制作用。方法:大鼠颈动脉球囊损伤后，局部转染AT2R重组腺病毒载体（pAdCMV/AT2R）或空病毒载体（pAd-GFP），于术后7、14和21 d用RT-PCR、免疫组织化学及HE染色方法，进行AT2R、AngⅡ 1型受体(AT1R)、PCNA在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析；免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测血管中AT2R与PCNA表达的关系。结果: pAdCMV/AT2R转染后，大鼠颈动脉AT2R的表达水平显著高于未转染组和pAd-GFP组(P<0.01)，21 d时仍维持较强表达。在14 d时pAdCMV/AT2R组PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组［(27.29±5.81)% vs ( 72.25±4.47)%、(68.43±9.12)%，P<0.01］，在AT2R表达阳性的部位PCNA表达阴性。在21 d时，pAdCMV/AT2R组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和pAd-GFP组(0.78±0.06 vs 1.44±0.22、1.36±0.21, P<0.01)，pAd-GFP组和未转染组间无显著差异（P>0.05）；各组颈动脉AT1R表达水平无显著差异(P>0.05)。结论: AT2R基因在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生，AT2R基因转染后表达并发挥其生物学作用时，AT1R和AT2R之间不存在表达量上此起彼伏的关系，可能是建立在信号转导基础上的功能调节关系。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。