肝细胞生长因子对心肌细胞肥大的影响

目的 探讨肝细胞生长因子（HGF）在培养新生大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法 原代心肌细胞中进行，分对照组和不同浓度HGF组（1ng／mL、10ng／mL、100ng／mL），采用放射性同位素3H-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率。应用荧光定量PCR方法检测HGF对培养心肌细胞肥大相关基因ANF、B-MHC表达的影响。结果 HGF（1ng／mL、10ng／mL、100ng／mL）作用心肌细胞24h后可明显增加心肌细胞3H—leu的掺入量，分别增高2．15、4．66、2．51倍，与对照组比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；并可诱导心肌细胞ANF和B-MHC表达增加，ANFmRNA表达增加平均为（2．63±0．04，4．32±0．08，3．91±0．05），分别增高1．61、3．32、2．91倍，与对照组（1±0．00）比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；B-MHCmRNA表达增加平均为（2．14±0．03，2．81±0．07，2．42±0．06），分别增高1．10、1．82、1．41倍，与对照组比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；上述结果表明1ng／mL已经起作用，10ng／mL作用最强，100ng／mLHGF有所下降。结论 肝细胞生长因子可促进心肌细胞蛋白质合成速率和心肌细胞ANF、B-MHC表达增加，它可直接促进心肌细胞的肥大。     

自发性高血压大鼠NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性

目的：探讨自发性高血压大鼠（SHR）NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性.方法：对SHR和同源血压正常大鼠（WKY）进行平均血压、左室重量（LVW）和体重（BW）的测定，同时采用实时定量荧光检测两组大鼠心肌组织中NHE-1 mRNA的拷贝数.结果：SHR组与WKY组相比，SHR组的LVW、LVW/BW明显高于WKY组（r左室重=0.700，r左室重/体重之比=0.617，P＜0.01），大鼠的平均血压与LVW量、LVW/BW呈正相关（P＜0.01）；SHR组的心肌组织NHE-1 mRNA的表达增高（P＜0.01）.结论：SHR的心肌组织NHE-1 mRNA的表达增高，提示NHE-1可能参与心肌肥厚的发生、发展过程.     

5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷联合吉西他滨对胰腺癌细胞株原钙黏蛋白8基因表达的影响

目的 研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因DNA启动子甲基化的转录调控,以及联合吉西他滨对癌细胞生长抑制与凋亡的影响.方法 采用MTT法、流式细胞术检测5-Aza-CdR及联合吉西他滨对Capan-2细胞的抑制率与凋亡率.应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR和Western blot的方法检测不同浓度5-Aza-CdR处理细胞前后PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 5-Aza-CdR能使胰腺癌细胞Capan-2增长速度减慢,呈浓度依赖性,联合吉西他滨显著抑制细胞生长;5-Aza-CdR联合吉西他滨与单药组、对照组相比,可显著诱导细胞凋亡.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞Capan-2的甲基化,恢复mRNA表达水平和蛋白表达水平,并呈一定的浓度正相关.结论 5-Aza-CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2的高甲基化状态,解除DNA高甲基化导致的基因沉默,重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达,同时可抑制胰腺癌细胞生长,与吉西他滨有协同抗肿瘤作用.     

大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5′端调控序列初步分析

目的　分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因 5′端调控区域和相应转录因子的特性。方法　克隆 1 760bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的 5′端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其 11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验 (EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子。结果　实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的 11个缺失体。将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性:GCLC Luc(-1 758 /+2 Luc),缺失体 1(-1 231 /+2 Luc),缺失体 2(-1 108 /+2 Luc),缺失体 3(-1 087 /+2 Luc),缺失体 4(-876 /+2 Luc),缺失体 5(-745 /+2 Luc),缺失体 6(-705 /+2 Luc),缺失体 8(-613 /+2 Luc),缺失体 9(-595 /+2 Luc),缺失体 10( -403 /+2 Luc)和缺失体 11( -111 /+2 Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(28     

HIV/AIDS病人合并HCV感染对HAART不良反应的影响

目的研究合并丙型肝炎病毒(HCV)感染,对艾滋病病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)病人接受高效抗反转录病毒治疗(HAART)后,不良反应发生的影响,为HIV/AIDS合并HCV感染的综合治疗提供依据。方法前瞻性观察167例合并HCV感染的HIV/AIDS患者(HIV/HCV组),接受HAART治疗2-5年出现不良反应的类型、频率、严重程度,以同期264例HIV/AIDS患者(HIV组)作为对照组。结果 167例合并HCV感染的HIV/AIDS患者中,163例(97.6%)出现疲乏症状,163例(97.6%)发生胃肠道反应,107例(64.1%)出现肝功能异常,98例(58.7%)出现血脂升高,83例(49.7%)出现药物性皮疹,56例(33.5%)出现腹泻,52例(31.1%)出现贫血。与HIV组相比,HIV/HCV组出现肝功能损害的频率较高(P<0.05),但严重程度无明显差异(P>0.05),其余不良反应发生的类型、频率及严重程度无显著性差异(P>0.05)。结论 HIV/AIDS病人在HAART过程中可发生多种不良反应,合并HCV感染时更容易发生肝功能损害,选择HAART方案时应尽量选择肝毒性少的药物。     

腺病毒介导NK4基因和单核细胞趋化蛋白1基因共表达对胰腺癌细胞的影响

目的探讨腺病毒介导NK4基因联合单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）基因在胰腺癌中的共表达及对胰腺癌细胞的影响。方法利用重组腺病毒AD-MCP-1、AD-NK4分别单独和联合感染胰腺癌细胞株SW1990,荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法检测NK4和MCP-1的表达情况并观察其对胰腺癌细胞和血管内皮细胞生长的影响。结果当感染复数（MOI）为60efu/细胞时,SW1990细胞的感染效率接近100%,相应基因mRNA表达在AD-MCP-1组、AD-NK4组和联合组中感染后第5天达到最高,但是联合组中的MCP-1和NK4的表达水平要低于单一感染（P〈0.05）。相对于其他各组,联合感染后胰腺癌细胞的相对生长率没有明显的改变。AD-NK4组和联合组的上清均有抑制血管内皮细胞生长的作用,但两组比较差异无统计学意义。结论腺病毒介导NK4联合MCP-1基因感染胰腺癌SW1990细胞没有抑制作用,但NK4能够抑制血管内皮细胞的生长从而发挥抑癌作用。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

表达超抗原葡萄球菌肠毒素A的喉癌细胞的建立

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达载体并建立其稳定表达的喉癌细胞系。方法:根据标准葡萄球菌菌株ATCC13565中SEA基因序列,人工合成其编码区序列,然后亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建pSEA-IRES-EGFP重组质粒,再将重组质粒转染至喉癌Hep-2细胞,G418筛选获得抗性单克隆,用RT-PCR和ELISA法鉴定SEA在喉癌细胞中的表达。结果:合成的SEA基因亚克隆至真核表达载体pires-EGFP后,测序证实克隆的SEA序列与GenBank中标准葡萄球菌菌株ATCC13565的编码区序列完全一致;重组质粒转染喉癌Hep-2细胞后,经筛选2周获得抗性单克隆,挑选单克隆,RT-PCR扩增获得特异的基因片段。经ELISA分析,发现细胞培养上清液中SEA蛋白的含量达pg级水平。结论:成功构建了超抗原SEA基因的重组真核表达载体,转染至喉癌Hep-2细胞后,SEA基因能够在细胞表达并持续分泌SEA蛋白。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

C-erbB-2、MMP2在乳腺癌中的表达及相互关系探讨

目的 :探讨癌蛋白 (C erbB 2 )和基质金属蛋白酶 (MMP2 )在乳腺浸润性导管癌中的表达及相互关系。方法 :应用免疫组织化学S -P法对 5 6例乳腺浸润性导管癌的C erbB 2和MMP2的阳性表达进行检测分析。结果 :5 6例中有 37例 (6 6 % )C erbB 2过表达 ,39例 (6 9.6 % )MMP2过表达 ,C erbB 2和MMP2同时阳性表达者 32例(5 7 1% )。两者阳性率均随组织学分级升高而上升 ,但各级间未见明显差异 (P >0 .0 5 )。在转移组中 ,88.9% (2 4 /2 7)的病例C erbB 2过表达 ,85 .2 % (2 3/ 2 7)MMP2过表达 ,两者的过表达与转移呈正相关关系 (PC erbB 2 =0 .0 0 1,PMMP2 =0 .0 15 )。C erbB 2和MMP2阳性配对分析表明 ,两者间阳性表达互为正相关 (P <0 .0 0 5 ,r=0 .5 1)。结论 :在乳腺浸润性导管癌中 ,C erbB 2和MMP2的过表达提示转移增加 ,可以作为乳腺癌的预后指标。