Bcl-2基因在儿童髓母细胞瘤中表达的研究

目的：从凋亡之异常角度探讨儿童髓母细胞发生、发展及预后的生物学机制。方法：以84例获随访的儿童髓母细胞瘤组织（按术后生存期3、5、10年分为A、B、C三组）为研究对象，用原位杂交及免疫组化染色法分别检测Bcl-2mRNA和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，并用3^1末端标记法做原位细胞凋亡检测。结果：72例（85．7％）表达Bcl-2mRNA，其阳性率为A＞B＞C；PCNA阳性肿瘤组织细胞密度与肿瘤细胞Bcl-2mRNA表达水平增加，呈正相关，而凋亡肿瘤细胞密度与肿瘤细胞Bcl-2mRNA表达水平呈负相关。结论：儿童髓母细胞瘤中Bcl-2基因高表达可抑制其凋亡，细胞增殖与凋亡失衡可能是儿童髓母细胞瘤发生发展的重要环节。     

三氧化二砷对人肝癌细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响

目的研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导HepG2细胞凋亡及其机制。方法采用MTT法、形态学观察及流式细胞术方法检测As2O3对HepG2细胞的生长抑制、凋亡作用的影响,用Western blot检测As2O3处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达。结果As2O3对HepG2细胞有明显的抑制增殖作用,且呈浓度和时间依赖性,细胞呈典型的凋亡形态学改变,As2O3呈时间依赖性诱导HepG2细胞凋亡。As2O3处理不同时间后,Bcl-2蛋白表达水平下调,caspase-3蛋白表达水平升高。结论As2O3具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用,其机制可能与其下调Bcl-2蛋白的表达,促进caspase-3活化有关。     

细胞色素C依赖的线粒体途径在hTERT干扰促进肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

目的检测靶向RNAi抑制hTERT基因对HepG2肝癌细胞凋亡的促进作用及其与线粒体凋亡途径的关系，探讨hTERT干扰促进细胞凋亡的可能机制。方法收集第20代hTERT基因RNAi真核表达载体稳定转染细胞、对照细胞（转染空载体质粒）及未转染HepG2细胞，采用Western blot检测线粒体、胞质细胞色素C（cyt C）的表达及细胞内caspase-9、Bcl-2、Bax和hTERT的表达。结果与未转染细胞和对照细胞相比，转染细胞hTERT、Bcl-2和线粒体cyt C表达明显减少，Bax和胞质cyt C表达明显增加；未转染细胞及对照细胞仅见约46kD的前caspase-9条带，转染细胞可见46kD前caspase-9条带和35kD caspase-9 p35亚基条带。结论RNAi靶向抑制hTERT基因可通过抑制Bcl-2表达和促进Bax表达引起线粒体cyt C释入胞质，激活caspase-9促进HepG2肝癌细胞凋亡。     

CX43在应激性溃疡发生发展过程中的表达与细胞凋亡、增殖的关系

探讨细胞间隙连接蛋白43（CX43）在胃粘膜遭受应激损伤的变化及与细胞凋亡，增殖发生的关系。制作大鼠水浸－束缚应激（WRS）模型，采用原位末端标记（TUNEL）法检测WRS结束前后不同的时间点细胞凋亡的发生；免疫组化ABC法原位检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达，原位杂交检测CS43 mRNA表达变化。结果发现，正常大鼠胃粘膜上皮散在TUNEL－细胞，PCNA蛋白主要在胃腺颈部近胃小凹处呈中等阳性表达，CX43 mRNA在胃腺区呈中等阳性表达，WRS 2h-WRS后5h TUNEL-细胞较对照组明显增多，并逐步达高峰，PCNA蛋白和CX43 mRNA的表达明显低于对照组；WRS后8－12h TUNEL-细胞逐渐减少，而PCNA表达高峰，CX43 mRNA表达恢复并明显增加，WRS后24hTUNEL－细胞仍高于正常水平，PCNA及CX43表达基本恢复至正常水平，相关分析，CX43 mRNA表达与PCNA蛋白表达呈显著正相关，结果提示，CX43 mRNA的表达可能与胃粘膜腺细胞区细胞稳定，增殖和分化有关，并影响上皮细胞凋亡发生。     

移植胰腺冷缺血后细胞凋亡与Bcl-2Bax表达的研究

目的：探讨胰腺移植后供胰冷缺血损伤后细胞凋亡与Bcl-2、Bax表达的关系。方法：建立小型猪胰腺移植冷缺血再灌注模型，根据供胰冷缺血时间（CIT）分为：CIT 0h组、CIT 3h组、CIT 6h组、CIT 9h组。切除受体猪胰腺制作成糖尿病模型，胰腺移植完成30min后观察胰腺病理变化及TUNEL法检测胰腺细胞凋亡、免疫组织化学法进行Bcl-2、Bax测定。结果：CIT 3h、CIT 6h、CIT 9h组供胰细胞凋亡指数（AI）明显高于冷缺血时间0h组，随着冷缺血时间的延长Bcl-2表达及Bcl-2／Bax比率逐渐下降，Bax表达则逐渐增强。结论：冷缺血时间越长，胰腺细胞凋亡程度越重，细胞凋亡不仅与Bcl-2、Bax自身表达水平有关，也与Bcl-2／Bax比率失衡有关。     

大鼠急性心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡与Bcl—2／Bax蛋白的表达

目的：为了证实急性心肌缺血再灌注过程中存在着不同程度的心肌细胞凋亡现象,初步研究心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax蛋白表达的关系。方法：电镜观察心肌细胞的超微结构变化,抽提心肌组织DNA琼脂糖凝胶电泳,TUNEL法原位标记凋亡的心肌细胞,免疫组化技术和图像分析技术检测心肌细胞内Bcl-2/Bax蛋白表达。结果：缺血及再灌注组电镜观察心肌细胞出现典型凋亡超微结构特征,TUNEL染色可见不同程度的心肌细胞凋亡阳性反应,DNA电泳显示在缺血再灌注2h组出现明显的DNA ladder,再灌注较在缺血组心肌细胞中Bcl-2表达明显降低（P＜0．05）,而Bax表达明显增高＊（P＜0．05）,结论：急性心肌缺血及再灌注能诱导不同程度的心肌细胞凋亡,Bcl-2/Bax基因对心肌细胞凋亡的发生有着重要的调控作用。     

创伤性脑损伤后细胞凋亡及Bcl-2基因治疗

目的 研究创伤性脑损伤（TBI）后的细胞凋亡情况，并探讨Bcl-2基因治疗对凋亡的作用。方法 60只SD大鼠随机分成TBI组（15只）、假处理组（15只）、基因治疗组（15只）和空载体对照组（15只）。除了假处理组外，所有大鼠均用Feeney自由落体致伤装置制成TBI模型。通过RT—PCR法克隆Bcl-2基因cDNA，并利用重组真核表达载体转染受损的脑细胞。用免疫荧光法检测Bcl-2基因的表达。原位末端标记法和电镜检测细胞凋亡情况。结果 与假处理组相比，TBI组的伤灶周围可以发现更多凋亡细胞，并且两者之间的凋亡指数差异有统计学意义（P〈0．01）。通过脂质转染，Bcl-2基因成功在体内表达。基因治疗组的Bcl-2（＋）细胞的标记指数为（8．3±0．7）％，而在空载体对照组中仅为（0．9±0．2）％（P〈0．01）。结论 细胞凋亡存在于损伤的脑组织中，而Bcl-2基因治疗能抑制这种凋亡的发生，后者为TBI后早期干预促进脑细胞存活提供了一种可行的方法。     

c-fos反义寡核苷酸激活caspase 3诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的 探讨c-fos反义探针诱导人肝癌HepG2细胞凋亡以及caspase3在其中的作用.方法 人肝癌HepG2细胞分为3组,①对照组:加生理盐水10μl;②c-fos正义寡核苷酸(SO)处理组:加入SO 10μl(5μg/μl);③c-fos反义寡核苷酸(ASO)处理组:加入ASO 10μl(5μg/μl).各组细胞再培养1h后进行后续实验.采用Hoeschst 33258染色检测细胞凋亡情况,并分别运用实时荧光定量PCR和Western blotting 检测 caspese 3在mRNA和蛋白水平的表达变化.结果 Hoechst 33258细胞染色显示,对照组和SO处理组的细胞核为弥散均匀的圆形或椭圆形荧光,而ASO处理组的细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒、新月体或环状荧光,核同缩,部分切片可见核碎裂.PCR和Western blotting检测显示,与对照组和SO处理相比,ASO处理组caspase 3 mRNA和蛋白的表达均明显上调.结论 c-fos反义探针可以诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,且caspase 3参与了此过程.     

大鼠脑损伤后脑组织Bcl-2、Bax基因的表达及血清NO、SOD变化动态研究

目的 观察大鼠颅脑损伤后脑组织中Bcl-2、Bax表达和血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）的变化,探讨大鼠颅脑损伤后神经细胞凋亡机制。方法 选用大鼠48只,按时间段随机分为8组,采用自由落体法建立大鼠脑损伤模型,分别于伤后2、6、12、24、48小时及7、14天采取血清,制备脑组织切片,采用TUNEL法检测神经细胞凋亡,用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax,并测定血清中NO含量和SOD活性。结果 颅脑损伤后,TUNEL（＋）细胞和Bcl-2、Bax表达均明显升高,分别在伤后12、48小时达到高峰;NO含量迅速上升,12小时达到高峰;而SOD降低,48小时达最低点,随着时间的延长,各值均逐步恢复至对照组水平。结论 颅脑损伤后,NO可促使Bcl-2、Bax表达升高,但对Bax的影响更明显,引起细胞凋亡。相反,SOD降低了Bcl-2、Bax表达,抑制了细胞的凋亡。颅脑损伤后SOD的降低也是引起细胞凋亡的主要因素。     

Ad—HGF转染对HepG2细胞的生长抑制作用

目的：探讨Ad—HGF转染对HepG2生长抑制作用的影响。方法：用Ad—HGF转染HepG2细胞，检测HGF蛋白表达及对细胞凋亡的影响；并用裸鼠致瘤试验体内观察Ad—HGF对HepG2细胞致癌的影响。结果：转染后24hHGF即有表达，48h达高峰。并观察到Ad—HGF可促进HepG2凋亡，体内Ad—HGF可抑制HepG2细胞生长成瘤。结论：Ad—HGF在体外可抑制HepG2细胞增殖、促进其凋亡，体内抑制其致癌作用。     

醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞(HRMC)凋亡及Caspase-3表达的影响。方法取对数生长期的HRMC,分别采用含0、5、10、20μmol/L醋酸铅的完全培养液培养,于6、12、24、48h后以MTT法检测细胞增殖情况,并于培养24h后采用Hochest33342-PI染色法观测细胞的形态学变化,RT-PCR检测Caspase-3 mRNA的表达,细胞免疫化学法和Western blotting检测Caspase-3蛋白的表达。结果与对照组(0μmol/L)相比,5、10、20μmol/L的醋酸铅可不同程度地抑制HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示醋酸铅作用后HRMC呈凋亡形态学改变,细胞数量减少,核染色质凝集,核膜破裂。RT-PCR显示醋酸铅作用后Caspase-3 mRNA表达升高。细胞免疫化学和Western blotting检测显示醋酸铅作用后Caspase-3蛋白表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡,Caspase-3参与了该过程。     

环氧合酶2基因沉默诱导人肝癌细胞凋亡的作用观察

目的 观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞.半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列.采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示成功构建了2个表达COX-2shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66％和77.79％.选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30％,细胞增殖活性下降了 29.33％.在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83％、4.63％和4.47％,G0/G1期细胞比例分别为73.93％、61.2％和57.630％,而S期细胞比例分别为13.43％、26.03％和26.90％.Westernblotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25％(P＜0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93％(P＜0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义.结论 构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白(H)Bcl-2水平的作用.     

人参总皂甙对K562细胞凋亡相关基因XIAP和Survivin表达的影响

目的探讨人参总皂甙（TSPG）对K562细胞凋亡相关基因XIAP和Survivin表达的影响。方法采用四唑盐比色试验（MTT法）检测TSPG对K562细胞增殖的影响;Hoechst33342/PI荧光染色法观察K562细胞的凋亡;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测K562细胞XIAP和Survivin基因的mRNA的表达。结果TSPG在低浓度时有促进细胞增殖的作用（P〉0.05）,高浓度时逐渐出现抑制作用（P〈0.05）;荧光技术显示不同浓度TSPG培养K562细胞后24和48小时后凋亡细胞数目明显增多（P〈0.01）;TSPG下调K562细胞XIAP和Survivin基因的表达（P〈0.01）。结论TSPG通过下调K562细胞XIAP和Survivin基因的表达从而诱导K562细胞凋亡。     

Spred2基因对人肝癌细胞凋亡韵影响

目的观察Spred2对人肝癌细胞（HepG2）凋亡的影响。方法用阳离子脂质体瞬时转染pcDNA3．0,pcDNA3．0-Spred2到HepG2细胞,建立过表达Spred2的细胞模型。膜联蛋白（annexlFl）V．FITC／PI（7．AAD）双标通过流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹检测SprcdZ的表达水平。结果特柒Spred2基因能明显诱导HepG2细胞凋亡。另外,转染Spred2基因能显著地增强5一FU诱导HepG2细胞凋亡。结论Spred2对人肝癌细胞凋亡有调控作用。     

钩藤酸E通过线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡

目的研究钩藤酸E诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的机制。方法采用MTT法分析确定钩藤酸E对肿瘤细胞及对小鼠骨髓体外增殖抑制作用，显微镜观察分析细胞凋亡的形态学变化，乳酸脱氢酶测定分析细胞死亡机制，免疫印迹实验检测线粒体相关蛋白的表达。结果钩藤酸E可明显地抑制HepG2细胞生长，且呈明显的量效关系和时效关系，而对小鼠骨髓细胞无抑制作用。Hoechst33258荧光染色可见凋亡小体产生，乳酸脱氢酶分析证明钩藤酸E引起细胞死亡为凋亡和坏死同时进行。免疫印迹结果显示上调的Bax和下调的Bcl-2和Bcl-xL表达证实了钩藤酸E诱导的HepG2细胞凋亡是通过线粒体途径发挥作用，并导致细胞色素C的释放。结论钩藤酸E可明显地诱导HepG2细胞凋亡，并经历了线粒体信号转导途径。     

HIPK2对肝癌细胞HepG2生物学表型的调控机制研究

目的:研究外源同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)基因表达对人肝癌细胞系HepG2裸鼠成瘤性的影响及机制.方法:将人HIPK2基因的全长cDNA序列克隆至腺病毒载体(pAdeno-HIPK2),制备Adeno-HIPK2重组腺病毒.以50 pfu/细胞的Adeno-HIPK2感染HepG2细胞作为实验组,Adeno-lacZ感染作为阴性对照,未感染细胞作为空白对照,观察各组细胞的裸鼠成瘤性和细胞凋亡情况,并绘制细胞生长曲线.第6周取材,检测各组样品中HIPK2、JNK1、JNK2、P53、mdm2的水平和JNK激酶活性.结果:实验组细胞的裸鼠成瘤性明显降低,细胞凋亡率有所上升.实验组的P53和mdm2的蛋白表达分别是对照组的3倍和15%,JNK1和JNK2基本不变,但JNK激酶活性则升至对照组的5倍. 结论:HIPK2高表达可以激活JNK激酶途径,并有效提高细胞内P53水平,使HepG2细胞的裸鼠成瘤性下降,是肝癌生物治疗中重要目的基因.     

过表达miR-29c靶向抑制AKT2增强肝癌HepG2细胞放射敏感性的实验研究

目的 探讨miR-29c靶向AKT2对肝癌细胞HepG2放射敏感性的影响。方法 RT-PCR检测人正常肝THLE-3细胞和肝癌HepG2细胞中miR-29c表达。给予不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）的X射线照射后,RT-PCR检测HepG2细胞中miR-29c表达变化。经生物信息学预测并采用双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测miR-29c与AKT2的靶向关系。采用脂质体2000将miR-29c mimic/AKT2基因重组质粒和miR-29c inhibitor/慢病毒载体AKT2 shRNA转染至HepG2细胞中,并给予不同剂量X射线照射后,克隆形成实验和MTT实验检测miR-29/AKT2对HepG2细胞存活率和细胞活力的影响。结果 与THLE-3细胞相比,HepG2细胞中miR-29c明显降低,差异有统计学意义（t=17.816,P<0.05）;HepG2经2、4、6和8 Gy X射线照射后,细胞存活率较THLE-3细胞显著降低（t=4.541、6.823、7.218、9.363,P<0.05）,HepG2细胞中miR-29c表达显著下降（t=5.599、9.262、10.470、10.873,P<0.05）。miR-29c过表达可降低HepG2细胞存活率和细胞活力（t_存活率=4.307、7.668、7.668、6.894,P<0.05;t_细胞活力=3.443、8.116、13.434,P<0.05）;反之,抑制miR-29c表达则升高HepG2细胞存活率和细胞活力（t=4.003、6.713、7.141,P<0.05;t_细胞活力=4.282、5.113,P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明,AKT2是miR-29c的靶基因,Western blot检测结果显示,miR-29c可负向调控AKT2蛋白表达。沉默AKT2后,HepG2细胞的存活分数及细胞存活率趋势与miR-29c过表达相一致;反之,AKT2过表达则与抑制miR-29c表达相一致。结论 miR-29c可通过靶向AKT2增加肝癌细胞HepG2放射敏感性。     

低温等离子体联合辐射对三种癌细胞系放射增敏效应的研究

目的 探讨低温等离子体对人肝癌细胞系HepG2、非小细胞肺癌细胞系A549及人宫颈癌细胞系HeLa的放射增敏作用及其机制。方法 应用克隆形成实验观察低温等离子体对3种细胞的放射增敏作用;流式细胞仪分析3种细胞周期分布、凋亡率及活性氧含量;Western blot法检测单纯照射(R组)、单纯等离子体作用(P组)及其联合辐射(P+R组)对3种细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响。结果 低温等离子体对HepG2、A549及HeLa细胞均有放射增敏作用,放射增敏比(SER_D0)分别为1.28、1.32、1.29。HepG2、A549及HeLa细胞P+R组G₂/M期比例、凋亡率及活性氧含量与R组比较均明显增高(t_G2/M期=9.52、8.24、9.53,P<0.05;t_凋亡率=10.67、38.56、6.74,P<0.05;t_{活性氧含量}=9.41、15.42、13.53,P<0.05)。HepG2和A549细胞P+R组G₂/M期比例、凋亡率及活性氧含量与P组比较均明显升高(t_G2/M期=8.75、20.37,P<0.05;t_凋亡率=8.43、9.99,P<0.05;t_{活性氧含量}=4.82、5.27,P<0.05)。3种癌细胞中P+R组Bcl-2蛋白表达较R组降低,而Caspase-3蛋白表达升高。结论 低温等离子体可提高HepG2、A549及HeLa细胞系的放射敏感性,其对HepG2及A549细胞系的放射增敏机制可能与抑制亚致死损伤修复,使细胞周期阻滞在G₂/M期,以及提高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡有关。