基因重组HBV的构建及其表达反义RNA抗-HBV作用的研究

目的　探索利用乙型肝炎病毒 (HBV)作为基因治疗载体的可能性及检验其表达反义RNA抗HBV的作用。方法　在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达S或S启动子区的反义RNA ,整合于具有HBV复制的 2 .2 .15细胞 ,形成细胞克隆 ,酶联免疫吸附 (ELISA)法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,聚合酶链反应(PCR)法检测上清液中重组HBV颗粒。结果　 2 .2 .15 pMEP4组、2 .2 .15 SAS组和 2 .2 .15 PAS组对HBsAg平均抑制率分别为 (2 .74± 3.83) %、(6 6 .5 4± 4 .4 5 ) % (P <0 .0 1)和 (5 5 .18± 3.2 7) % (P <0 .0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为 (4 .4 6± 4 .2 5 ) %、(2 6 .36± 1.6 9) % (P <0 .0 1)和 (6 5 .5 4± 3.2 2 ) % (P <0 .0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 17.0 %、5 9.9%和 72 .8%。 2 .2 .15 SAS组及 2 .2 .15 PAS组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论　经过对HBV基因组的两处改造 ,分别在细胞内表达S区及S启动子区反义RNA具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;在 2 .2 .15细胞中野生型HBV辅助下 ,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒     

舒肝宁注射液体外抗HBV作用

目的采用体外细胞模型评价保肝护肝药物舒肝宁注射液(Shuganning Zhusheye,SGN)对Hep G2.2.15细胞中稳定复制的野生型(wild type,WT)HBV和Hep G2.A64细胞中稳定复制的恩替卡韦(entecavir,ETV)耐药型HBV的抗病毒及协同抗病毒作用。方法采用CCK8细胞计数法评价SGN细胞毒性作用,选择安全用药浓度系列稀释后单独或与对照药物[ETV及替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)]联合进行抗HBV实验,以对HBV DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率评价SGN的抗病毒作用。结果 SGN对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞的CC50分别为198.40μg/ml和85.81μg/ml;SGN单独使用对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为55.89%(t=14.195,P=0.0094)和46.29%(t=4.953, P=0.0037),SGN联合ETV对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为94.28%(t=9.745,P=0.00068)和54.75%(t=9.335,P=0.00028),SGN联合TDF组对HepG2.2.15和HepG2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为93.11%(t=9.274,P=0.00071)和88.27%(t=43.68,P=6.03×10-6);SGN对野生型HBsAg和HBeAg未见明显抑制作用(抑制率12.00%),对ETV耐药型HBsAg抑制率为19.69%～34.26%(t=39.118,P=0.028;t=19.73,P=0.0024)。8μg/ml SGN与低浓度(0.01μmol/L)ETV联合对WT型HBV DNA的抑制有协同效应,抑制率为86.28%(t=30.745,P=0.001)。8μg/ml SGN与低浓度(0.2μmol/L)TDF联合对ETV耐药型HBV的抑制有协同效应,抑制率为60.26%(t=7.568,P=0.017)。结论 SGN可显著抑制WT型和ETV耐药型HBV的复制,联合低浓度ETV或TDF有显著协同抑制作用。     

靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用

目的:设计并构建ASGPR1靶向的mieroRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因.设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达栽体.通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RTPCR和Western blot检测其对ASGPR1 mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1 mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P＜0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以amiRNAASGPR1-610抑制作用最强,对培养72 h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P＜0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P＜0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.     

肽核酸抑制HBV复制与表达的体外研究

合成肽核酸(PNA)片段,由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞与HBV各编码区保守区域相结合。用ELISA方法测定HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg滴度,PCR测定HBV DNA含量。通过计算抑制百分率,筛选有效PNA片段。结果在500 mol/L浓度下,PG3 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为51.03%、55.38%、20.10%;PG6 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为47.00%、43.10%、51.03%。表明PNA可由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞,从而抑制HBV的复制和抗原系统的表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果

目的:探讨针对HBV preS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系,作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBVDNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性最强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.     

反义锁核酸与拉米夫定在HepG2.2.15细胞中抗HBV作用的比较

目的:应用反义锁核酸与拉米夫定作用HepG2.2.15细胞,对他们抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)效果进行比较.方法:设计针对HBV翻译起始区S基因mRNA的反义寡核苷酸,并进行锁核酸修饰,以阳离子脂质体介导反义锁核酸转染HepG2.2.15细胞;拉米夫定组直接作用HepG2.2.15细胞;分别于用药后第2、4、6、8、10天收集细胞培养上清液.用ELISA法和FQ-PCR法检测收集上清液HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量.MTT法分别检测反义锁核酸与拉米夫定对细胞存活率的影响.结果:拉米夫定对HBVDNA具有明显抑制作用,最高可达46.52%,但对HBsAg、HBeAg影响较小;反义锁核酸对HBsAg、HBeAg及HBVDNA均有较强抑制作用,对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的最高抑制率分别达67.69%、59.71%和62.96%(P<0.05),且抑制随时间呈增高趋势.反义锁核酸与拉米夫定对细胞代谢均无明显影响.结论:反义锁核酸抗HBV作用机制与拉米夫定不同,反义锁核酸抗HBV作用明显优于拉米夫定.     

地塞米松、环磷酰胺和他克莫司三种免疫抑制剂影响HBV复制的体外研究

目的探讨地塞米松(DEX)、环磷酰胺(CYP)和他克莫司(FK506)在体外对HBV蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的DEX、CYP和FK506作用于HepG2.2.15细胞系,通过MTT实验确定药物安全浓度范围,通过检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,以及细胞内HBV DNA水平来评价HBV的表达和复制情况。结果DEX、CYP和FK506的药物安全浓度范围分别为0~500、0~1000和0~10μg/mL。与培养基对照处理相比,FK506处理后HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;CYP处理增加HBsAg分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;DEX作用减少HBsAg和HBeAg的分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但是细胞内HBV DNA复制水平差异无统计学意义(P0.05)。结论在药物安全浓度范围内,FK506对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制无直接抑制或促进作用。CYP处理后增加HepG2.2.15细胞HBsAg表达,但HBeAg表达及HBV DNA复制变化差异无促进作用;DEX处理抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达,但对HBV DNA复制无抑制作用。     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

低密度cDNA Macroarray对干扰素α抗病毒蛋白的筛选

目的 基于低密度cDNA Macoarray技术筛选出差异表达的干扰素(IFN)α抗病毒基因,以探讨IFN α抗病毒蛋白的表达与HBV复制的关系. 方法 以一定浓度的IFN α处理肝胚瘤细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞6h,用cDNA Macroarray分析比较两细胞株IFN α抗病毒基因表达谱,并筛选出差异表达的IFNα抗病毒基因.将表达HBV核心蛋白(HBc)的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,RT-PCR法分析HBc对IFN α抗病毒基因表达的影响.将表达抗黏病毒A蛋白(MxA)的表达质粒pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2.2.15,以酶联免疫吸附试验、Dot blot、Southern blot等方法分别检测HepG2.2.15细胞表达释放的HBsAg与HBeAg、细胞外HBV DNA和细胞内HBV DNA复制中间体(松弛环状DNA、双股线性DNA),以判断HBV复制情况.两组间数据比较采用t检验,组间不同时间点数据比较采用单因素方差分析.结果 cDNA Macroarray分析显示HepG2和HepG2.2.15细胞的抗病毒基因表达谱具有差异性:IFNa抗病毒基因中干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)1、IFITM2、IFITM3、RING4等在HepG2.2.15细胞的表达被部分抑制,而重要的抗病毒蛋白MxA表达被完全抑制.HBc转染组细胞中MxA mRNA表达的相对水平为0.31±0.05,低于空白对照组的0.74±0.04,差异有统计学意义,P＜0.05.MxA蛋白转染HepG2.2.15细胞48、72 h后,MxA转染组细胞上清液中HBsAg的S/CO值分别为1.42+0.21和1.58±0.18,HBeAg的S/CO值为1.44±0.14和2.28±0.24,而空白对照组细胞上清液中HBsAg的S/CO值为1.92±0.19和2.79±0.25,HBeAg的S/CO值为2.31±0.46和3.37±0.29,两组细胞上清液中HBV抗原的S/CO值差异均有统计学意义,P值均＜0.05.细胞外HBV DNA、胞内HBV复制中间体DNA均无明显变化.结论 HBV及其抗原成分的复制和表达影响着IFNα抗病毒蛋白的表达;HBV通过抑制IFN α抗病毒蛋白的表达而发挥拮抗IFNα的抗病毒活性.     

丁型肝炎患者肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA相关性研究

目的探讨丁型肝炎患者肝组织中HDAg与HBsAg,HBcAg和HBV DNA表达及相关性.方法应用免疫组化双重染色及连续切片技术和原位杂交,检测了79例丁型肝炎患者肝组织HDAg,HBsAg,HBcAg和HBVDNA表达,以52例乙型肝炎作对照.结果丁型肝炎HBsAg,HBcAg检出率为81%,71%,乙型肝炎为94%,92%,两组比较有显著性差异(P＜0.05或0.01).HDAg以肝细胞核表达为主,其次是胞质表达,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,两种抗原的表达程度与肝组织的炎症活动和病理损害相关(P＜0.01).HBcAg以以肝细胞核表达为主,阳性细胞主要呈单个细胞或点状分布,且HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞.HDAg表达强度与HBV DNA表达呈负相关(P＜0.05).结论HDV感染会抑制HBV DNA复制或病毒抗原表达;在HDV致病机制中HDV的直接细胞毒性可能起主要作用,也有HBV的协同作用.     

Effective inhibition of expression of hepatitis B virus genes by DNAzymes

AIM: To evaluate the inhibitory effects of DNAzymes on the expressions of hepatitis B virus (HBV) s (HBsAg) and e (HBeAg) in 2.2.15 cells, and to explore the potential therapeutic effects of DNAzymes on replication of HBV genome. METHODS: DNAzymes DrzBS and DrzBC specific to HBV (ayw subtype) s gene ORF A157UG and e gene ORF A1816UG, were designed and synthesized. Inhibitory effects of DrzBS or DrzBC on the expressions of HBV s and e genes as well as HBV DNA levels in culture supernatants were observed in 2.2.15 cells. RESULTS: After being treated with DrzBS or DrzBC, the expression of HBV s or e genes in 2.2.15 cells was depressed dramatically. The maximum inhibition rate was 94.2% and 91.8% for DrzBS and DrzBC, respectively. The concentration for effective inhibition of both DrzBS and DrzBC was within 0.1-2.5 μmol/L, showing a dose-dependence. The efficiency of inhibiting HBsAg, HBeAg in 2.2.15 cells by DrzBS or DrzBC was higher than that of the same target genes by antisense oligonucleotides (ASON). The concentration for effective inhibition of DNAzymes was at least 10-fold lower compared with ASON controls. Neither inhibition on the replication of HBV DNA nor toxicity to 2.2.15 cells was observed. CONCLUSION: DrzBS and DrzBC can block the expression of HBV s- and e-genes in 2.2.15 cells and provide a specific and effective anti-HBV gene therapeutic means.     

腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用

目的观察针对HBV(乙型肝炎病毒)C区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法采用亚克隆技术,从pGEM—Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于腺病毒表达载体pAd-CMV中。利用Lipofectamine2000介导,将重组病毒pAdCMV—Rz及pAdCMV—laz感染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA(酶联免疫)、免疫荧光、共聚焦定量、图象分析法、Western blot分析Hbe/HBcAg的表达。结果感染的2.2.15细胞2周后,打点杂交证实可表达针对HBV C区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达68.6％,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Western blot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论该双位点核酶通过针对HBV C区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

Effective inhibition of expression of hepatitis B virus genes by DNAzyrnes

AIM: To evaluate the inhibitory effects of DNAzymes on the expressions of hepatitis B virus (HBV) s (HBsAg) and e (HBeAg) in 2.2.15 cells, and to explore the potential therapeutic effects of DNAzymes on replication of HBV genome. METHODS: DNAzymes DrzBS and DrzBC specific to HBV(aywsubtype) s gene ORF A157UG and e gene ORF A1816UG,were designed and synthesized. Inhibitory effects of DrzBS or DrzBC on the expressions of HBV s and e genes as well as HBV DNA levels in culture supernatants were observed in 2.2.15 cells.RESULTS: After being treated with DrzBS or DrzBC, the expression of HBV s or e genes in 2.2.15 cells was depressed dramatically. The maximum inhibition rate was 94.2% and 91.8% for DrzBS and DrzBC, respectively. The concentration for effective inhibition of both DrzBS and DrzBC was within 0.1-2.5 μmol/L, showing a dosedependence. The efficiency of inhibiting HBsAg, HBeAg in 2.2.15 cells by DrzBS or DrzBC was higher than that of the same target genes by antisense oligonucleotides (ASON). The concentration for effective inhibition ofDNAzymes was at least 10-fold lower compared with ASON controls. Neither inhibition on the replication of HBV DNA nor toxicity to 2.2.15 cells was observed.CONCLUSION: DrzBS and DrzBC can block the expression of HBV s- and e-genes in 2.2.15 cells and provide a specific and effective anti-HBV gene therapeutic means.     

慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）与血清HBV DNA之间的相关性及其与临床的关系。方法 78例慢性乙型肝炎患者入选本研究。肝组织β- globinDNA、HBV cccDNA和HBV tDNA采用实时荧光定量PCR方法检测,平均每个肝细胞HBV cccDNA和HBV tDNA含量（拷贝/cell）=HBV cccDNA（实测值）/β-globin DNA（实测值）和HBV tDNA（实测值）/β3-globin DNA（实测值）,肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA含量的计算单位定义为log₁₀拷贝/10⁶cell;采用实时荧光定量PCR、ELISA法检测血清HBVDNA和HBV标志物;采用免疫组织化学方法检测肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达。统计分析采用pearson相关分析及t检验。结果 （1）肝组织HBV cccDNA与HBV tDNA定量呈正相关（r=0.696,P<0.001）;肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.304,P<0.01）;肝组织HBV tDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.341,P<0.01）;（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义和（P均>0.05）;（3）肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义（P>0.05）;（4）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量与HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者比较差异均无统计学意义（均P>0.05）;（5）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA以及血清HBV DNA三者与肝脏炎症活动度及纤维化程度均无显著相关性（P>0.05）。结论 （1）血清HBV DNA定量结果并不一定能完全反映患者肝组织中HBV cccDNA和HBV tDNA含量,尤其在血清HBV DNA<500拷贝/mL时,肝组织中仍存在HBV cccDNA和HBV tDNA,且含量大小不等。（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性或者HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量均明显高于阴性患者;而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量均没有显著差异;（3）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA均没有显著差异;（4）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA及血清HBV DNA与肝脏炎症活动度和纤维化程度均无显著相关性。     

甲胎蛋白启动子介导反义乙型肝炎病毒X基因在肝癌细胞中的表达及其作用

目的 构建含甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子的反义乙型肝炎病毒X基因(HBX)真核表达载体，研究其特异性和有效性，为开发肝癌细胞特异性HBX反义RNA基因治疗乙型肝炎病毒(HBV)奠定基础。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBX(1370—1872nt)基因，克隆至EB病毒表达载体，双轮PCR筛选、鉴定基因插入方向。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，Northernblot检测HBX mRNA的表达，酶联免疫试验(ELISA)检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果 成功构建正、反义RNA表达载体pEBAF—s—HBX、pEBAF—as—HBX。Northernblot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达。pEBAF—as—HBX转染3d后，可显著抑制2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，其HBsAg、HBeAg抗原表达较正义对照分别下降37．9％和36．8％，HBV DNA降低25％。结论 反义RNA表达载体pEBAF—as—HBX仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

A novel HBV antisense RNA gene delivery system targeting hepatocellular carcinoma

AIM: To construct a novel HBV antisense RNA delivery system targeting hapatocellular carcinoma and study its inhibitory effect in vitro and in vivo.METHODS: GE7,a 16-peptide specific to EGFR, and HA20,a homologue of N-terminus of haemagglutinin of influenza viral envelope protein, were synthesized and conjugated with polylysin. The above conjugates were organized into the pEBAF-as-preS2, a hepatocarcinoma specific HBV antisense expression vector, to construct a novel HBV antisense RNA delivery system, named AFP-enhancing 4-element complex. Hepatocelluar carcinoma HepG2.2.15 cells was used to assay the in vitro inhibition of the complex on HBV. Expression of HBV antigen was assayed by ELISA.BALB/c nude mice bearing HepG2.2.15 cells were injected with AFP-enhancing 4-element complex. The expression of HBV antisense RNA was examined by RT-PCR and the size of tumor in nude mice were measured.RESULTS: The AFP-enhancing 4-element complex was constructed and DNA was completely trapped at the slot with no DNA migration when the ratio of polypeptide to plasmid was 1:1.The expression of HBsAg and HBeAg of HepG2.2.15 cells was greatly decreased after being transfected by AFP-enhancing 4-element complex. The inhibitory rates were 33.4 % and 58.5 % respectively. RT-PCR showed HBV antisense RNA expressed specifically in liver tumor cells of tumor-bearing nude mice. After 4 injections of AFP-enhancing 4-element complex containing 0.2 μg DNA, the diameter of the tumor was 0.995 cm&#177;0.35,which was significantly smaller than that of the control groups (2.215 cm&#177;025, P&lt;0.05).CONCLUSION: AFP-enhancing 4-element complex could deliver HBV antisense RNA targeting on hepatocarcinoma and inhibit both HBV and liver tumor cells in vitro and in vivo.     

乙型肝炎病毒S/C基因位点反义锁核酸在小鼠体内抗病毒疗效研究

目的 探讨针对HBV S/C双基因位点反义锁核酸对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法 将30只HBV转基因小鼠随机分为5组,每组6只.分别为5%葡萄糖液对照组、空脂质体对照组、单靶区S组,单靶区C组、双靶区SC组.反义锁核酸片段经尾静脉注入小鼠体内,采用时间分辨免疫荧光技术定量检测血清HBsAg;实时荧光聚合酶链反应定量检测血清HBV DNA含量;逆转录聚合酶链反应检测肝组织HBV C-mRNA的表达;免疫组织化学法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达,自动牛物化学分析仪检测血清白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐;小鼠肝,肾脏做常规病理切片,观察反义锁核酸对小鼠脏器的影响.应用SPSS12.0统计学软件分析.各组问比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验. 结果注射锁核酸后,对HBsAg的表达均显示有较强的抑制作用,单靶区S组,单靶区C组和双靶区SC组的平均抑制率分别为36.6%、31.5%和54.9%;对HBV DNA的复制也有抑制作用,平均抑制率分别为24.0%,21.1%和35.8%.注射后1、3、5 d,HBsAg的平均抑制率分别为14.4%、25.6%和31.3%;HBVDNA的平均抑制率分别为11.0%、19.2%和24.1%;血清中白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等指标,各组结果与对照组比较,差异均无统计学意义;小鼠肝细胞的HBsAg、HBcAg阳性细胞数均较对照组明显减少.小鼠肝,肾脏组织学表现未见异常. 结论 HBV S/C基因位点反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基冈鼠HBV复制和表达有显著抑制作用,且双基因靶位优于单基因靶位.