沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定,再用Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式PCR(Semi-nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因;利用限制性内切酶Hind Ⅲ对半嵌套式PCR产物进行酶切,从而验证半嵌套式PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明,半嵌套式PCR是一种快速、灵敏的检测转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的方法。      

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

  目的   “Gene-deletor”系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。  方法   以含有“Gene-deletor”系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。  结果   （1）相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。（2）Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,（3）花粉GUS组织染色结果表明,“明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。  结论   在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动“动启动子驱动达基因,平均清系统（LoxP/FRT）的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。      

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。     

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

  目的  探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。  方法  以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。  结果  （1）共获得6株T₀代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T₁代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T₁代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。  结论  定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。      

转fps基因烟草纯合系的获得及其特性分析

携带有外源法呢基焦磷酸合酶（fps）基因和卡那霉素抗性基因（Npt—Ⅱ）的烟草种子在含卡那霉素（300mg／L）的培养基上能够正常地萌发和生长，对照种子虽能萌发，但幼苗形态与对照有着明显的差异。转fps基因植株所具有的卡那霉素抗性和与其抗病性之间密切相关，由此建立了一种鉴定转基因烟草后代纯合度的简易方法，得到4个fps转基因烟草纯合系（K-4、K-6、K-17、K-35），并对其农艺性状、田间抗性、化学成份和品质进行了评估，其中K-4转基因品系的综合性状较原有品种有所提高。     

利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数

为分析转基因水稻外源基因拷贝数，利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法进行转基因水稻外源基因拷贝数的分析。转基因外源基因的拷贝数通过转基因水稻外源基因(GUS和HPT基因)和水稻内标准SPS基因含量的比较计算获得。定量分析了14株T0代的转基因水稻植株，得到了外源基因插入分别为1、2、3和4的转基因植株，同时利用Southern Blot方法进行验证分析。随机选择18个已经过定量PCR检测分析的转基因水稻植株，用Southern Blot的方法分析转基因水稻植株中的HPT或GUS基因的拷贝数，Southern Blot分析结果显示有15个转基因水稻植株的分析结果与定量PCR分析的结果是一致的，3个植株定量PCR分析的转基因拷贝数稍高于Southern Blot的分析结果，主要原因是Southern Blot方法在同一个插入位点有多拷贝的T-DNA片段插入时，转基因植株的基因组在完全酶切时会产生相似的DNA片段，电泳分析时很难分辨清楚。定量PCR方法则完全避免了这种情况的发生，除非目的基因DNA片段在PCR引物处发生断裂。两种方法分析结果的比较显示定量PCR方法分析转基因拷贝数更加有效、适用。     

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析

重组克隆ＤＮＡ用ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ双酶切得到马铃薯Ｙ病毒ＮＩｂ基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，叶盘法将ＮＩｂ基因转入烤烟品种ＮＣ８９的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、ＰＣＲ检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株ＤＮＡ中整合了外源目的基因，且表现抵抗２０μｇ／ｍｌＰＶＹＮ的侵染，ＥＬＩＳＡ分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对ＰＶＹＮ侵染具有较高抗性的转基因烟草植株。     

fps转基因烤烟类胡萝卜素及其降解产物的研究

为探索法呢基焦磷酸合酶(fps)对烤烟中类胡萝卜素及其降解产物的影响,利用常规和GS/MS方法,对转fps基因烟草株系(K-4、K-6、K-17、K-35)烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香气物质含量进行了分析,结果发现,烤后烟叶类胡萝卜素含量有较大差异,与未转基因对照相比普遍有所提高,其中K-35含量最高;8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量有不同程度的提高,其中K-35香气降解产物含量整体较高,表明外源fps基因在烟草中的表达对类胡萝卜素合成具有促进作用,从而有利于烟叶品质的提高。     

转TaDREB3基因大豆的品质等同性分析

将抗逆基因TaDREB3转入大豆品种东农50,得到3个稳定遗传的株系,并将T4株系种子播于大田中。对3个转TaDREB3基因株系及非转基因对照株系的种子分别进行蛋白质、油份、脂肪酸、异黄酮等品质性状的等同性分析,研究转化外源基因TaDREB3后大豆原有品质性状是否有改变。结果表明：3个转基因株系和对照植株相比,蛋白质含量、油分含量和脂肪酸含量均差异不显著;转基因株系1的大豆黄素虽然和对照差异显著,但是异黄酮总含量和对照没有显著性差异。说明TaDREB3基因的导入并没有改变大豆的品质性状。     

烟草抗花叶病新品系“转墓因NC89”选育技术的研究

本文报导了国内首例抗烟草花叶病毒（ＴＭＶ）和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的转基因双抗烟草新品系的选育方法，获得了具有抗ＴＭＶ和ＣＭＶ的双抗优质新品系。在新品系第４—６代的田间试验中，验证了其抗病毒特性的遗传稳定性；与对照品种ＮＣ８９在农艺性状、品质和烘烤特性等方面进行比较，证明转基因抗病新品系除抗病性显著增强外，其它特性均略优于原ＮＣ８９良种。１９９２年在河南省示范推广６６６７ｈｍ~２，转基因抗病新品系对烟草花叶病的相对控制效果为５０％－７０％，防病增产的经济效益显著。     

不同生长物质复配处理对烤烟种子萌发的影响

为了更好地提高烟草催芽种子的质量,尤其是改善陈种子的萌发能力,实验采用不同浓度的MS营养液、GA3、IBA、6-BA及4者复配对K326、NC89新陈2类种子进行催芽处理,统计分析不同条件催芽处理后的种子萌发率、各项生理生化指标变化以及萌发相关基因的表达。结果表明,各因素单独催芽处理,在适宜浓度范围内均能促进种子萌发。而采用生长物质复配配方（1/20 MS＋100 mg/L GA3＋2 mg/L IBA＋0.2 mg/L 6-BA和1/20 MS＋100 mg/L GA3＋2 mg/L IBA＋2 mg/L 6-BA）催芽处理,种子萌发迅速且各项生理生化指标显著优于对照。此外,WRKY2基因的表达量在催芽处理后显著提高。     

茉莉酸浸种对云烟87斜纹夜蛾抗性的影响

为明确茉莉酸（Jasmonic acid,JA）浸种对烟草抗虫性的影响,测定了JA浸种的云烟87对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的抗性及植株中JA和茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）的含量。结果表明,以JA浸种的云烟87为食物的斜纹夜蛾幼虫重量比未浸种的降低了15%。在模拟斜纹夜蛾取食后,JA浸种的云烟87幼苗诱导出的JA含量比未浸种的增加41%,JA-Ile含量增加42%。斜纹夜蛾取食的JA浸种的云烟87幼苗,其抗虫次生代谢物如咖啡酰丁二胺、二咖啡酰亚精胺、尼古丁和二萜糖苷的含量分别增加60%,79%,19%和29%,胰蛋白酶抑制剂活性增强80%。同时,JA浸种后6周,云烟87植株干质量与对照植株差异不显著。JA浸种可以提高云烟87对斜纹夜蛾的抗性,同时不影响其产量。     

Seed-specific expression of the lysine-rich protein gene sb401 significantly increases both lysine and total protein content in maize seeds

The sb401 gene from potato (Solanum berthaultii) encoding a pollen-specific protein with high lysine content was successfully integrated into the genome of maize plants, and its expression was correlated with increased levels of lysine and total protein content in maize seeds. A plasmid vector containing the sb401 gene under the control of a maize seed-specific expression storage protein promoter (P19z) was constructed and introduced into maize calli by microprojectile bombardment. The integration of the sb401 gene into the maize genome was confirmed by Southern blot analysis, and its expression was confirmed by Western blot analysis. Quantification of the lysine and protein contents in R1 maize seeds showed that, compared with the nontransgenic maize control, the lysine content increased by 16.1% to 54.8% and the total protein content increased by 11.6% to 39.0%. There were no visible morphological changes in the vegetative parts and seeds of the transgenic maize plants. Lysine and protein analysis of the transgenic maize grains showed that the levels of lysine and total protein remained high for six continuous generations, indicating that the elevated lysine and total protein levels were heritable. These results indicate that the sb401 gene could be successfully employed in breeding programs aimed at improving the nutritional value of maize.