米诺环素对压力作用下体外培养神经细胞凋亡的抑制

目的在开放式压力控制培养系统作用下体外培养大鼠视网膜神经细胞（retinal neurons，BNs），观察米诺环素对其活性及凋亡的影响，并进一步探讨其对受损RNs保护的可能机制。方法采用出生0～3d的Sprague Dawley（SD）大鼠视网膜神经细胞体外混合培养，制备RNs加压培养模型。通过细胞形态学观察、四唑盐（MTT）比色法测定细胞活力、吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）染色法检测细胞的凋亡率来观察米诺环素对上述损伤细胞的保护及治疗作用，以及应用免疫细胞化学染色法，观察诱导型一氧化氮合酶（iNos）和半胱天冬酶-3（caspase-3）表达的改变。结果加压培养后，在倒置显微镜下RNs与对照组相比形态改变较明显，细胞活力降低，大量细胞发生凋亡（占53．93％），而米诺环素治疗组（20μmol／L）细胞则形态改善，活力显著增高，凋亡数目减少（占17．29％），差异具有显著性（P〈0．05）。免疫细胞化学染色法示米诺环素治疗组细胞内iNOs和caspase-3表达较加压损伤组减少。结论一定剂量的米诺环素在体外可有效抑制压力引起的大鼠视网膜神经细胞损伤及凋亡，抑制iNOs和caspase-3的表达可能是其潜在作用机制。     

热休克蛋白70在视网膜神经元和Müller细胞 中的诱导及其保护作用 

目的评价大鼠视网膜神经元（RNs）和Müller细胞中热休克蛋白（HSP）70的诱导表达，及其对低糖和谷氨酸损伤的视网膜神经元的保护作用。方法大鼠RNs和Müller细胞体外培养体系分别经过热休克处理（42℃下1 h）及免疫细胞化学法检测HSP70表达的时间经过；并对RNs进行低糖(0.56 mmol/L葡萄糖，作用6 h)和谷氨酸(100 μmol/L,作用 6 h)兴奋毒性损伤，四唑盐（MTT）比色法评价细胞存活能力，同时用HSP70抗体阻断其表达。结果热休克后大鼠RNs和Müller细胞中HSP70高效表达；经热休克预处理，RNs在低糖和谷氨酸盐损伤后的细胞活力明显提高，该现象可被HSP70抗体阻断。结论热休克能够诱导RNs和Müller细胞高效表达HSP70，从而增强RNs对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的耐受能力。(中华眼底病杂志,2005,21:110-113)     

热休克蛋白70在视网膜神经元和Müller细胞中的诱导及其保护作用

目的评价大鼠视网膜神经元(RNs)和Müller细胞中热休克蛋白(HSP)70的诱导表达,及其对低糖和谷氨酸损伤的视网膜神经元的保护作用. 方法大鼠RNs和Müller细胞体外培养体系分别经过热休克处理(42℃下1 h)及免疫细胞化学法检测HSP70表达的时间经过;并对RNs进行低糖(0.56 mmol/L葡萄糖,作用6 h)和谷氨酸(100 μmol/L,作用 6 h)兴奋毒性损伤,四唑盐(MTT)比色法评价细胞存活能力,同时用HSP70抗体阻断其表达. 结果热休克后大鼠RNs和Müller细胞中HSP70高效表达;经热休克预处理,RNs在低糖和谷氨酸盐损伤后的细胞活力明显提高,该现象可被HSP70抗体阻断. 结论热休克能够诱导RNs和Müller细胞高效表达HSP70,从而增强RNs对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的耐受能力.     

细胞因子对培养的人视网膜色素上皮细胞早期生长反应基因-1的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞早期生长反应基因-1（Egr-1）的影响。 方法 体外培养人RPE细胞，采用免疫荧光染色、Western blotting和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定性定量观察不同刺激因素作用下Egr-1蛋白和mRNA的表达变化。刺激因素包括：20 μg/ml脂多糖（LPS）、40 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF） α、10 U/ml 干扰素（IFN） γ、30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液和正常人玻璃体液分别刺激0(未受刺激)、10、20、30、40、60 min。结果 在未受刺激的RPE细胞中Egr-1呈弱阳性表达，细胞浆为浅黄绿色荧光，随着刺激因素的作用，Egr-1的表达明显增强，细胞浆和部分细胞核呈强绿色荧光。20 μg/ml LPS、40 ng/ml TNF α、10 U/ml IFN γ、30％THP-1细胞上清液和玻璃体液刺激RPE细胞后，与未受刺激的RPE细胞相比，Egr-1 mRNA的最大增强幅度分别为19、13、14、12、14倍，Egr-1蛋白的最大升高幅度分别为34、12、17、32、13倍。 结论 LPS、TNF α、IFN γ、THP 1细胞上清液和玻璃体液可上调体外培养的人RPE细胞Egr-1 mRNA和蛋白的表达，且出现核转位现象，说明这些刺激因素可引起Egr-1的活化。     

促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞光化学损伤的保护作用

目的 观察重组人促红细胞生成素（EPO）在人视网膜色素上皮(RPE)细胞光化学损伤中的保护作用并探讨其作用机制。 方法 取成人RPE（ARPE）19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型，光照12 h后再培养24 h终止培养，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）法和流式细胞双染色法检测不同浓度的EPO干预治疗前后RPE细胞活性的变化及细胞凋亡的变化，并添加酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子Jak/STAT的阻断剂（AG490）探讨人重组EPO对人RPE细胞光化学损伤的保护性作用及其保护性机制。 结果 EPO可明显增强 RPE细胞的细胞活性，各组中以40 IU/ml EPO组细胞活性的增强结果最明显；明显减少光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡，以40 IU/ml EPO组结果最明显。在加入AG490（Jak2激酶抑制剂）组，EPO对细胞活性的增强作用和抑制凋亡作用均被阻止。 结论 EPO对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用，其保护作用机制主要通过EPO与其受体结合后保护作用机制起作用。     

应用二维电泳法对视网膜色素上皮细胞光损伤后蛋白质组学的初步研究

目的 应用二维电泳法观察光损伤后视网膜色素上皮细胞蛋白质组的表达。 方法 运用冷白光以（2200±300）Lx光照人视网膜色素上皮细胞(ARPE 19)6 h，建立光损伤模型；提取细胞可溶性蛋白并通过二维电泳分离和凝胶图像分析，寻找光损伤细胞的蛋白质谱变化。 结果 软件分析显示全细胞可溶性蛋白在图谱上出现（390±10）个清晰斑点,11个蛋白斑点有明显表达差异。光损伤细胞内8种蛋白表达上调,1种下调，2种蛋白表达缺失。 讨论 二维电泳实验能够找出光损伤RPE细胞与正常细胞的蛋白表达差异，为进一步研究在此改变中发挥重要作用的蛋白质奠定基础。     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

米诺环素对大鼠视网膜诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨米诺环素对大鼠视神经损伤后的保护作用。方法观察米诺环素对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。成年SD大鼠54只（右眼54只）,随机分为正常组6只（右眼6只）、实验组24只（右眼24只）、对照组（右眼24只）。后两组均制备右眼视神经钳夹伤模型,伤后1h分别给予45mg／kg米诺环素和等量生理盐水腹腔注射,此后1次／d。于伤后1、3、7、14d取材,观察视网膜组织形态学变化,利用计算机图像分析技术对经免疫组织化学染色后视网膜组织中iNOS表达的平均光密度值进行半定量检测。结果1d、3d,7d及14d实验组iNOS表达水平明显较对照组降低（t1d=9．497、t3d=11．203、t7d=15．622、t14d=4．889,均P〈0．001）。结论米诺环素可通过抑制视神经钳夹伤后视网膜组织中iNOS的表达,而对损伤视神经起到抗氧化和抗凋亡作用。     

大鼠出生后发育过程中视网膜Nogo受体蛋白表达的研究

目的 观察Nogo受体（NgR）蛋白在大鼠出生后发育过程中视网膜上的表达及其意义。 方法 使用免疫荧光组织化学技术及激光共聚焦显微镜观察48只大鼠出生后0、3、7、14、21、35、49、63 d视网膜NgR蛋白的表达情况。每组6只大鼠。 结果 NgR蛋白在出生后整个发育过程中的大鼠视网膜上表达均为阳性，荧光染色位于细胞膜及突起。 结论 NgR蛋白的阳性表达提示髓磷脂蛋白抑制因子和NgR之间的相互作用对神经元塑形的过程可能不仅是抑制作用，而是促进和抑制双向作用，从而达到对神经元塑形过程的调控。     

经瞳孔温热疗法诱导血管内皮细胞凋亡研究

目的 探讨血管内皮细胞凋亡在经瞳孔温热疗法(TTT)治疗脉络膜新生血管(CNV)中的作用。 方法 对体外培养的血管内皮细胞进行单纯TTT干预、升温处理和吲哚青绿（ICG）预处理后TTT干预，使用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ（annexin Ⅴ FITC）及碘化丙啶双荧光标记流式细胞仪检测和荧光显微镜检测、DNA荧光染料烟酸己可碱(hoechst)33258对细胞核进行染色、DNA ladder检测和透射电子显微镜形态学观察等方法进行细胞凋亡的检测。 结果 在没有明显升温情况下，TTT干预不能引起血管内皮细胞凋亡的增加；而单纯升温作用和ICG预处理后TTT干预可明显诱导血管内皮细胞的凋亡，后者更为明显，且随着TTT照射功率的增加和照射后培养时间的延长，凋亡率进一步上升。 结论 诱导血管内皮细胞凋亡可能是TTT封闭CNV的作用机制之一，结合ICG预处理可以在同样升温条件下明显提高凋亡的诱导效率。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA及其蛋白表达的影响

目的 研究不同压力下纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)中诱导一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA及其蛋白质的表达,探讨青光眼患者RGCs损伤的机制。方法 将纯化培养的Sprague-Dawley大鼠RGCs随机分成对照组A,B,C,及D组,分别在0,20,40,60及80mmHg(1mmHg=0.133KPa)的压力下培养48h后,用原位杂交,RTPCR及Western blot法检测RGCs中iNOSmRNA及其蛋白质的表达,并用全自动图像分析系统测定其吸光度值。结果 纯化培养的RGCs纯度为98％。原位杂交,RT－PCR及Western blot法检测RGCs中iNOS mRNA及其蛋白表达结果变化均呈平行关系;对照组无表达,A组有较弱的表达信号,B,C及D组表达逐渐增强;3项检测结果用全自动图像分析显示;A组iNOSmRNA均弱表达,与对照组比较差异有显著意义（P＜0．05）;B,C及D组均为强表达,各组与对照组比较差异有非常显著意义（P＜0．01）。结论 压力可激活RGCs中iNOSmRNA及其蛋白质的表达,由此产生过量的NO损伤RGCs成为青光眼的发病因素之一。     

缺血再灌注大鼠视网膜诱导型一氧化氮合酶与细胞凋亡的研究

目的　探讨缺血再灌注大鼠视网膜诱导型一氧化氮合酶 (induciblenitricoxidesynthase ,iNOS)的表达、视网膜细胞凋亡的发生以及二者之间的关系。 方法　采用前房灌注生理盐水的方法制作实验性视网膜缺血再灌注损伤模型 ,分别于再灌注不同时间点取材 ,行免疫组织化学法染色iNOS阳性细胞 ;TUNEL法检测视网膜凋亡细胞 ;透射电镜观察视网膜超微结构。结果　缺血再灌注早期 ,视网膜主要表现为内层水肿增厚 ,晚期主要表现为视网膜萎缩变薄、神经节细胞减少。缺血再灌注 3h组视网膜神经节细胞层及内核层细胞出现iNOS弱阳性表达 ,12h组阳性表达达高峰 ,与其余各组比较差异有显著意义 (P <0 .0 1) ,2 4、4 8h组iNOS表达渐减少。视网膜组织细胞凋亡见于缺血再灌注 12、2 4及 4 8h组 ,凋亡细胞主要位于内核层 ,且 2 4h组凋亡阳性表达最强 ,与其他各组比较差异有显著意义 (P <0 .0 1)。结论　缺血再灌注大鼠视网膜iNOS表达增加 ,介导视网膜缺血再灌注损伤 ;视网膜细胞的损伤部分以凋亡的形式发生 ,iNOS的表达可能对细胞凋亡的发生起一定的诱导作用。     

Protektive Wirkung Blaulicht absorbierender IOLs auf das menschliche retinale Pigmentepithel

Methods

Primary human RPE cells were exposed to white light and either a SN60AT or SA60AT IOL was placed in the light beam. After 15–60 min of irradiation, viability, induction of apoptosis and cell death were determined in primary human RPE cells. Expression of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and the anti-apoptotic XIAP protein and their mRNA were determined by RT-PCR, Western blot analysis and ELISA.

Results

Light exposure decreased cell viability depending on the duration of irradiation. Light-induced cell death and apoptosis as well as decrease of XIAP expression and cellular viability were significantly reduced by both the SN60AT and SA60AT IOL. In addition, these protective effects regarding light-induced cell damage were significantly stronger in the presence of the blue light-filtering SN60AT IOL compared to the SA60AT IOL.

Conclusion

Both UV-filtering and blue light-absorbing IOLs reduce light-induced RPE damage. The blue light-absorbing IOL further reduced damage compared to the conventional IOL, which supports the hypothesis of possibly also preventing retinal damage in clinical use.     

静态压力对大鼠视网膜微血管内皮细胞内皮素-1和NO表达的影响

目的观察静态压力变化对大鼠视网膜微血管内皮细胞（RMECs）形态、增生活性及分泌血管活性物质内皮素-1（ET-1）和一氧化氮合酶（NOS）的影响。方法体外培养并鉴定大鼠RMECs,分为A（1．33kPa）、B（2．67kPa）、C（5．33kPa）和D（10,67kPa）组和未加压对照组。用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,常规方法进行细胞计数,锥虫蓝染色检测活细胞比例。用Griess硝酸还原酶法检测NO代谢产物NO2^-／NO3^-的含量,放射免疫法检测培养细胞的ET-1蛋白表达;用RT-PCR法半定量研究RMECs中ET-1、eNOS、iNOS mRNA的表达。结果B、C、D组RMECs细胞核膨大,胞体拉长,可见少量悬浮细胞;静态压力促进RMECs增生（F=12．205,P〈0．01）,C组和D组细胞数量高于对照组、A组和B组（P〈0．01）;静态压力升高造成各组细胞损伤,拒染率降低（F=11．180,P〈0．01）,B、C、D组细胞拒染率低于对照组（P〈0．05）。B、C、D组ET-1浓度较对照组增加（P〈0．01）。C组和D组RMECs培养液中NO2^-／NO3^-浓度高于对照组（P〈0．01）。B、C、D组RMECs中ET-1 mRNA表达较对照组升高,差异有统计学意义（P〈0．01）;C组和D组RMECs中eNOS mRNA和iNOS mRNA表达较对照组升高,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论高静态压力可直接导致RMECs的结构损伤,高静态压力下RMECs合成ET-1、NO增多可能是高眼压眼底病变的机制之一。     

Control of peroxyntrite -induced production of inducible nitric oxide synthase isoforms and antagonism of cholecystokinin octapeptide-8 in retinal pigment epithelial cells in vivo

AIM: To explore if peroxyntrite （ONOO－) induced iNOS via Fas/ Fas/L pathway in diabetic rats and the effection of cholecystokinin octapeptide-8 (CCK-8) as therapeutic agent for decrease diabetic retinopathy. METHODS: Thirty-six rats were taken as control group, seventy two were given (streptozotocin) STZ (45mg/kg) and then divided into ONOO－group and CCK-8 group (peritoneal injection CCK-8). STZ-induced diabetic rats were treated with CCK-8 for 60 days. Western blotting analysis, DNA ladder, RT-PCR, immunohistochemistry and flow cytometry were used for determining the expression of nitrotyrosine (NT, the foot print of ONOO－); apoptosis and inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA as well as Fas/Fasl signal transduction in RPE cells. RESULTS: Both RPE cells in ONOO－ and CCK-8 group developed apoptosis and expressed NT, iNOS mRNA and Fas/Fasl. But latter delayed the all changes in a time-dependent manner compared with control and ONOO－ group (P＜0.001). iNOS and Fas/Fasl were up-regulated and associated with an increase of expression of ONOO－in vivo. CONCLUSION: The study suggested that apoptosis of RPE was partly induced by ONOO－ may be the new way of oxidative damage to the RPE cells. CCK-8 decreased RPE cells apoptosis partly induced by ONOO－ and is a potential drug for therapy of diabetic retinopathy. The mechanism of CCK-8 dealing with RPE cells may be related to its direct inhibition of the formation of iNOS to produce ONOO－ and antagnism of damage of ONOO－ to RPE cells.