基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立

目的建立基于抗氧化反应元件(antioxident responseelement,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物。方法构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响。结果在加入25μmol.L-1H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100μmol.L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用最强,金雀异黄素诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25μmol.L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用最强,茨非醇诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.5倍。结论利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

基于STAT3转录调节的筛药模型的建立

目的　依据造血生长因子信号转导途径中重要转录因子STAT3的转录调节作用建立基于报告基因的靶向STAT3转录调节的筛药模型 ,用此模型筛选具有G CSF样活性的化合物。方法　构建诱导性表达载体 pTKS3 CAT并转染入表达G CSF受体的NFS 6 0不依赖细胞 ,筛选报告基因CAT表达受rhG CSF诱导的阳性克隆 ,采用ELISA法检测化合物对CAT表达活性的影响。同时 ,对模型的特异性和灵敏性进行检测。结果　在转染有重组质粒的NFS 6 0不依赖细胞中 ,CAT表达受rhG CSF诱导并呈剂量依赖关系 ,EC50 等于 0 0 44nmol·L-1,而rhEPO不能诱导CAT表达。结论　以上模型的CAT基因表达活性能够被其特异性配体强诱导表达 ,利用此模型在 96孔板上用ELISA法测定CAT基因的诱导表达水平可筛选具有G CSF样活性的化合物。     

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型，以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element，ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP，并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中，筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol，E₂)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察，同时考察模型的稳定性及时效量效关系，以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中，SEAP报告基因的表达受E₂的诱导并呈剂量与时间依赖关系，E₂对阳性克隆细胞无增殖作用，本模型的Z′因子值为0.7，免疫细胞化学染色结果表明，转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。     

基于报告基因和NF-κB信号通路的抗阿尔茨海默病药物细胞筛选模型的建立与应用

目的建立基于报告基因和核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的药物筛选模型,探讨不同化学结构类型的化合物对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NF-κB信号通路的抑制作用。方法构建带有NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体(TATA-like promoter-NF-κB-secreted alkaline phosphatase,pTAL-NF-κB-SEAP),并将其转入人胚肾细胞(HEK293)中,考察模型的稳定性、时效、量效关系以及脂多糖对细胞的增殖作用。结果转染pTAL-NF-κB-SEAP的HEK293细胞中SEAP报告基因的表达受脂多糖的诱导并呈剂量与时间依赖关系,脂多糖对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z′因子为0.88。结论利用此模型通过测定分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)报告基因的诱导表达水平可筛选NF-κB信号通路抑制剂。     

基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用

目的　建立基于报告基因的雌激素受体α亚型配体的筛选模型，用此模型对收集到的化合物进行筛选，以发现具有新结构的雌激素受体配体。方法　构建诱导性表达载体并转染入ERα ⁺HepG2细胞中，筛选报告基因CAT表达受雌二醇诱导的阳性克隆。采用ELISA法检测化合物对CAT表达的影响，体外细胞存活实验对化合物进行功能性检测。结果　ERα ⁺HepG2细胞中CAT的表达受雌二醇的诱导并呈现剂量依赖关系。化合物三羟基二苯乙烯诱导CAT表达的最大活性为雌二醇的1.75倍。结论　利用此模型通过测定CAT基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的雌激素受体配体。     

卡介菌多糖核酸对肺结核病人外周血细胞因子mRNA表达的调节

目的 :观察活动性肺结核病人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞因子信息核糖核酸 (mRNA)表达特点以及卡介菌多糖核酸的调节作用。方法 :活动性肺结核病人和健康志愿者各 15例 ,分离单个核细胞。分 3组进行培养 ,A组为不加刺激物的对照组 ,B组加入结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD) ,C组加入卡介菌多糖核酸 (BCG PSN )。检测PBMCγ 干扰素 (IFN γ) ,肿瘤坏死因子 (TNF α)和白细胞介素10 (IL 10 )mRNA表达。结果 :活动性肺结核病人PBMC在A组IFN γmRNA的表达明显低于健康者 ,P <0 .0 1,TNF α与IL 10mRNA的表达与健康人无差异。在B组IFN γmRNA和TNF αmRNA表达与健康人无差异 ;IL 10mRNA的表达增强 ,与健康人比较 ,P <0 .0 1。在C组 ,IFN γmRNA的表达增强 ,仍低于健康人 ,P <0 .0 5 ;TNF αmRNA的表达有增加 ,与健康人比较 ,P >0 .0 5 ,IL 10mR NA的表达无改变。结论 :活动性肺结核病人保护性细胞因子IFN γ减低 ;BCG PSN刺激可提高免疫细胞IFN γmRNA ,但不增高IL 10mRNA的生成     

白细胞介素2激活骨髓抗肿瘤机理的实验研究

目的　探讨白细胞介素 2 (IL 2 )激活的骨髓 (ABM )抗肿瘤作用的免疫学机理。方法　取恶性血液病缓解期患者骨髓 ,分离单个核细胞 (MNC) ,与IL 2共同孵育后 ,测定CD3-CD86 、CD2 8 、CD8 CD2 8 、CD3-CD16 /CD5 6 的细胞比例及上清液中肿瘤坏死因子α(TNF α) ,干扰素γ(IFN γ)的含量。结果　 (1)培养 72小时后 ,实验组CD3-CD86 细胞、CD2 8 细胞、NK细胞比例及上清中TNF α和IFN γ的含量均比对照组增高 (P <0 0 5 )。 (2 )培养 1周后 ,实验组CD3-CD86 比对照组显著增高 (P <0 0 1) ,CD2 8 细胞、NK细胞比例、CD8 CD2 8 均增高 (P <0 0 5 )。结论　 (1)ABM中CD3-细胞表面共刺激分子CD86表达明显增加 ,与ABM中特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的生成有关。 (2 )ABM中活化B细胞、NK细胞、CTLs、TNF α和IFN γ也直接或间接地参与了ABM的抗肿瘤作用     

重组人胸腺素α原体外对IFN-γ、IFN-α及TNF-α的影响

目的　在体外实验中考察克隆并表达的人胸腺素α原 (prothymosinα ,ProTα)对几种重要细胞因子IFN γ、IFN α和TNF α分泌的影响。方法　在体外分离脾淋巴细胞、脾巨噬细胞及腹腔巨噬细胞 ,用ELISA法检测ProTα对IFN γ、IFN α和TNF α分泌的影响。结果　 10 - 7mol·L- 1 ProTα明显促进脾细胞分泌IFN γ(P <0 .0 5 ) ,该浓度的ProTα也明显刺激小鼠脾巨噬细胞分泌IFN α(P <0 .0 1) ;在小鼠腹腔巨噬细胞中 ,ProTα能明显刺激IFN α和TNF α的分泌 (P <0 .0 1)。结论　在体外实验中 ,ProTα对细胞因子IFN γ、IFN α和TNF α的分泌均有促进作用 ,这为ProTα进一步体内研究奠定了基础     

干扰素α型与γ型对慢性乙型肝炎患者抗纤维化治疗的3年随访观察

目的　比较两种类型及不同剂量的干扰素治疗慢性乙型肝炎纤维化的远期疗效 ,以期探索较为合理、有效的药物阻断慢性肝炎纤维化 ,预防肝炎肝硬化的发生。方法　 96例中、重度慢性乙型肝炎患者 ,随机分为 3组 ,IFN α、IFN γ和对照组 ;用药时间为 6个月。治疗期间 ,每月观察肝功能 (ALT ,TBil)、血常规。疗程结束时及此后每 6个月 ,观察肝功能、血清肝纤维化指标透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原 (Ⅳ C)、Ⅲ型前胶原肽 (PⅢP)、HBVDNA以及B超检查。结果　 3组病例ALT均显著下降。IFN治疗组HBVDNA阴转率显著高于对照组 ,且IFN α组高于IFN γ组 ,以B超检查显示门脉主干内径及脾静脉最大内径恢复正常值为指标进行治疗前后对比 ,结果显示 :治疗组明显优于对照组。IFN α组与IFN γ组之间无差异。观察各组于疗程结束后第 12个月、2 4个月、36个月的情况 ,以观察指标出现异常者为复发。显示复发情况如下 :对照组 >IFN γ组 >IFN α组。结论　IFN α和IFN γ制剂均具有抑制HBVDNA复制 ,治疗慢性乙肝纤维化作用 ,本组 3年疗效观察结果表明IFN α较IFN γ疗效显著且复发率低     

链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定

目的 从链霉菌2754中提取分离和纯化小分子VEGF受体抑制剂,并进行结构鉴定.方法 以酪氨酸酶活性测定方法(EuSA法)为活性跟踪方法,利用大孔吸附树脂反相HPLC等方法进行分离纯化.利用光谱分析,进行结构解析.结果 分离纯化到两个七尾霉素类化合物nanaomycin αA和nanaomycin βA并具有相关活性.结论 Nanaomycin αA和nanaomycin βA为己知化合物,首次报道该化合物具VEGFR拮抗活性.     

Dynavax公司推进免疫刺激技术

正在开发免疫刺激 DNA序列 ( ISS)的美国 Dynavax技术公司称其已取得突破 ,这将使它能在第一代 ISS技术的基础上继续开发 ,制备能调节免疫应答的更有效的高度特异性化合物。　　公司确定了刺激人免疫系统细胞产生 α和 γ干扰素 ( IFN- α,IFN- γ)所需的最短 Cp G基元 ,IFN-α和 IFN-γ能激活 Th1型应答 ,从而促进巨噬细胞活化和细胞介导免疫产生。　　公司的研究者发现短至 5个碱基的寡核苷酸能刺激 IFN产生。先前 ,科学家认为刺激细胞产生免疫活性所需的最短长度为 1 2个核苷酸。但是假如这些序列含有后面连有至少 2个核苷酸…     

慢性阻塞性肺病血清IL-6、TNF-α、I FN-γ的作用及意义

目的 :探讨血清白细胞介素6(IL 6)、肿瘤坏死因子α(TNF α)和干扰素γ(IFN γ)在慢性阻塞性肺病(COPD)气道炎症发病中的作用。方法 :采用双抗体夹心ABC ELISA法对COPD(COPD组 )、肺气肿、COPD合并肺心病 (肺心病组 )及正常对照组血清IL 6、TNF α、IFN γ进行测定。结果 :肺心病组和COPD组血清IL 6、TNF α水平均明显高于对照组 (P<0 05) ,血清IFN γ水平明显低于对照组 (P<0 05)。且2组患者血清IL 6与TNF α呈正相关 (P<0 05) ;肺心病组血清IL 6、TNF α水平均高于COPD组 ,但差别无统计学意义。2组患者吸烟组IL 6、TNF α水平均显著高于非吸烟组 (P<0 05)。吸烟年限、每日吸烟量与IFN γ呈负相关 (P<0 05) ,与TNF α呈正相关 (P<0 05)。结论 :IL 6、TNF α、IFN γ参与COPD患者气道炎症反应 ,吸烟可加快COPD气道炎症的进展。     

rhIL-10对银屑病动物模型的治疗作用及免疫功能的影响

目的　研究重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )对银屑病动物模型的治疗作用以及免疫功能的影响。方法　用小鼠雌激素期阴道上皮模型、鼠尾鳞片表皮模型观察重组人白细胞介素 10的抗银屑病作用 ,并检测ConA诱导T淋巴细胞增殖、LPS诱导B淋巴细胞增殖、NK细胞活性及细胞因子(IFN γ、IL 2、IL 1、TNF α)水平。结果　rhIL 10 (5 ,2 0 ,80μg·kg-1·d-1,sc)对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂有抑制作用 ,促进小鼠尾鳞片颗粒层的形成。对ConA诱导T淋巴细胞增殖反应及IL 2、IFN γ产生有抑制作用 ;对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生IL 1、TNF α具有抑制作用 ;对NK细胞活性有抑制作用 ;对LPS诱导B淋巴细胞增殖有促进作用。结论　rhIL 10可能是通过抑制表皮细胞增殖与促进其分化 ,并参与抗炎与免疫调节过程而发挥治疗银屑病动物的作用     

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1~S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。     

无细胞异种真皮基质临床应用的免疫反应特征

目的　探讨临床应用异种猪 /异体人无细胞真皮基质 (s /h ADM )的免疫反应特征。方法　在临床大面积烧伤患者深度切痂创面上 ,将s ADM或h ADM与超薄断层自体皮重叠移植 ,采用免疫组化和原位杂交方法检测移植物中CD3、CD4、CD8、γ 干扰素 (IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )阳性细胞的百分比 (% ) ,以及IFN γ和IL 4mRNA的表达水平。结果　浸润于ADM组织中免疫细胞以CD4和IL 4阳性细胞为主 ,与免疫组化结果一致 ,IL 4mRNA在所有标本中均有较高的表达水平 ,s ADM组表达显著强于h ADM组 (P <0 0 5 ) ,在发生排异反应前的s ADM组织中IL 4mRNA和IFN γmRNA一样阳性细胞均明显增加 ,而排异后两者均显著下降 ;IFN γmRNA仅在h ADM组移植早期有弱阳性表达 ,与s ADM组统计学有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,接近于断层中厚自体皮片移植物。结论　s ADM移植后的免疫应答是由异种组织特异性蛋白引发的Th2淋巴细胞介导的体液免疫过程。     

人参果提取物对H_2O_2诱导人脐静脉内皮ECV304细胞损伤的保护作用

目的:研究人参果提取物对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞)损伤的保护作用。方法:体外培养的ECV304细胞随机均分为正常对照(常规培养液)组、模型(常规培养液)组与人参果提取物1、2、3、4(10、20、40、80μg/ml)组,给予相应药物培养ECV304细胞24 h后,用H2O2(0.3 mmol/L)培养ECV304细胞4 h以复制细胞氧化损伤模型;采用MTT法检测细胞活力以筛选最适质量浓度。体外培养的ECV304细胞随机均分为正常对照(常规培养液)组、模型(常规培养液)组与人参果提取物(80μg/ml)组,给予相应药物培养ECV304细胞24 h后同上复制细胞氧化损伤模型。采用HE染色观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期;检测丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:人参果提取物最适给药质量浓度为80μg/ml。与正常对照组比较,模型组细胞部分皱缩,边缘模糊,细胞有融合现象;细胞活力减弱;G1期细胞比例升高,S期和G2期细胞比例降低;SOD活性减弱,MDA含量增加,LDH活性增强,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,人参果提取物组细胞损伤程度减轻;G1期细胞进入S期和G2期的细胞比例升高,G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高;SOD活性增强,MDA含量减少,LDH活性减弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:人参果提取物对H2O2损伤的ECV304细胞具有保护作用,其机制可能与加快细胞周期进程、抗氧化作用有关。     

晚期糖化终产物受体、核因子-κB双基因反义RNA抑制糖化终产物刺激的炎症因子表达

目的:观察晚期糖化终产物受体(receptor ofadvanced glycation endproducts,RAGE)、核因子-κB(NF-κB)双基因反义RNA对晚期糖化终产物(ad-vanced glycation endproducts,AGEs)刺激ECV304细胞分泌炎症因子的影响。方法:酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法观察AGEs对ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6的影响,应用脂质体将RAGE、NF-κB单/双基因反义RNA转染ECV304,流式细胞仪、筛选低表达RAGE、NF-κB的细胞株,观察RAGE、NF-κB双基因反义RNA对AG-Es刺激ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6的影响。结果:AGEs可引起ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6增加,诱导作用具有时间和剂量依赖规律。稳定转染筛选出低表达RAGE、NF-κB的细胞株,在AGEs100 mg.L-1诱导下双基因转染细胞ECV-asRAGE-asP65克隆中RAGE、NF-κBp65表达抑制率分别为(62.2±8.7)%及(37.2±7.1)%。AGEs 100 mg.L-1刺激下ECV-asRAGE-asP65克隆分泌TNF-αI、L-6较空载体转染细胞、单基因转染细胞减少更明显(P<0.01)。结论:RAGE、NF-κB双基因反义RNA可抑制AGEs刺激的ECV304细胞的TNF-α和IL-6释放。     

IL-18抗体对急性免疫性肝坏死动物模型的影响

目的探讨白细胞介素(IL) 18 抗体干预,了解IL 18 抗体对急性免疫性肝坏死动物模型的影响。方法取BALB/c 小鼠18 只,随机平分为三组A组(正常对照组);采用结核菌苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导法建立急性免疫性肝损伤模型B组(单纯病理组);抗体治疗组(C组)在模型形成前用IL 18抗体干预。实验结束取所有BALB/c小鼠肝组织,行病理学肝组织炎症活动度计分(HAI),血清IL 18由ELISA法检测,肝组织IL 18、肿瘤坏死因子α(INF α)、干扰素γ(IFN γ)由RT PCR检测。结果C组HAI 3 333±1 633,明显低于B组19 000±0 548(P<0 05);B组血清IL 18明显较C组增高(P<0 05);B组肝组织IL 18、IFN γ、INF αmRNA表达水平明显较C组增高(P<0 05)。结论IL 18、IFN γ、TNF α在急性免疫性肝坏死动物模型的形成中发挥重要作用,IL 18抗体可干预其形成。     

肌肉注射卵白蛋白/白细胞介素18融合DNA可有效诱导抗原特异性Th1型免疫应答

Th1型细胞可选择性分泌白细胞介素 2( IL- 2 )、γ干扰素 ( IFN- γ)和 β肿瘤坏死因子( TNF- β) ,调节以补体结合和调理抗体 (如Ig G2 a同种型抗体 )产生为特征的细胞介导免疫。作者构建了一种携带卵白蛋白 ( OVA)和 IL - 1 8( IFN-γ诱导因子 ) c DNA融合基因的哺乳动物细胞表达质粒 p OVA/IL- 1 8,并在 C57BL/6小鼠中研究了其是否能有效诱导抗原特异性 Th1型免疫应答。　　作者首先对含 SV4 0复制起点并表达免疫球蛋白基因的哺乳动物细胞表达质粒进行修饰 ,以去除其中绝大部分免疫球蛋白编码区及新霉素抗性基因 ,随后分别…