卫氏并殖吸虫囊蚴-童虫特异性血清学抗原的提纯、鉴定与抗该抗原单克隆抗体的研究 Ⅱ、抗P.wMJ-Sag McAb的制备和检定

本研究以卫氏并殖吸虫囊蚴-童虫特异性血清学抗原(P.wMJ-Sag)免疫短程感染卫氏并殖吸虫(P.w)囊蚴的BALB/c小鼠,取后者脾细胞与SP_2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经三次亚克隆培养,从384孔中筛选出8个能持续分泌抗P.wMJ-Sag的单克隆抗体(McAb)株。应用ELISA检测BALB/c小鼠腹水效价表明,对Pw囊蚴粗抗原,腹水效价最高为1:10~4;对P.w-MJ-Sag,效价均达1:10~6。经免疫双扩散证实,8个McAb均为IgG_1亚类。     

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

丰宫并殖吸虫成虫特异性抗原的研究

目的筛选丰宫并殖吸虫病的特异性诊断抗原.方法应用圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳(Disc-PAGE)分析了丰宫并殖吸虫成虫抗原,筛选出特异性诊断抗原成分,以对流免疫电泳(CIEP)证实其特异性.结果经电泳得到11条蛋白区带,其中的1、5成分只与丰宫并殖吸虫阳性血清出现明显反应,与异盘并殖吸虫及日本血吸虫无交叉反应(P＜0.001),而且兔抗5抗原成分血清显示出较高的反应滴度(1128),推测其可能具有较丰富的、稳定的某一类型抗原表位.以CIEP进一步证实,1、5两蛋白抗原成分与丰宫并殖吸虫感染阳性大鼠血清及兔抗1、5血清均呈现清晰沉淀带.结论1、5蛋白成分可作为特异诊断抗原,用于丰宫并殖吸虫病的免疫血清学诊断,尤其5成分有较高的免疫活性.另外,4、6蛋白成分分别与异盘并殖吸虫及日本血吸虫有交叉反应现象.     

用单克隆抗体测定血吸虫病循环抗原Ⅰ.一株具有诊断意义的单克隆抗体的特异性分析

本文报道用40:B1 McAb检测曼氏血吸虫感染者血或尿中血吸虫成虫循环阴极(M)抗原具高度特异性。用曼氏血吸虫成虫排泄/分泌抗原(ESA)(含循环阴极(M)抗原)免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得数株能识别阴极(M)抗原的McAb。用IFA分别定位于成虫肠道、体部和皮层,抗体亚类分别为IgG_3,IgM或IgG_1。分析了其中一株McAb 40:B1(IgG_3,用IFA定位于成虫肠道和体部)检测血吸虫循环抗原的特异性。     

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。     

卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定

目的 表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwAg)基因，并评价其应用于免疫学诊断的价值。方法 用IPTG诱导表达已亚克隆人表达载体pRESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因，以SDS—PAGE和Westernblot分析鉴定表达产物。结果 SDS-PAGE电泳可见32ku处有1条明显的蛋白质带，该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别。结论 成功构建重组克隆PwAg，其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性，推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断。     

卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定

目的　表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原 (Pw Ag)基因 ,并评价其应用于免疫学诊断的价值。　方法　用 IPTG诱导表达已亚克隆入表达载体 p RESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因 ,以 SDS- PAGE和 Western blot分析鉴定表达产物。　结果　 SDS- PAGE电泳可见 32 ku处有 1条明显的蛋白质带 ,该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别。　结论　成功构建重组克隆 Pw Ag,其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性 ,推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断。     

卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的筛选和免疫反应性分析

目的 初步探讨卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的免疫反应性。方法 应用卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Pw-Ig)筛选噬菌体随机12肽库,对筛选到的抗原模拟表位用ELISA检测其免疫反应性,并与卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwA)进行比较。结果 获得的6个卫氏并殖吸虫抗原模拟表位(即P5、P6、P7、P8、P13、P16)特异性和敏感性与PwA相比差异均无显著性(P>0.05),其中P5、P6和P7交叉反应性明显较PwA低(x2=4.630,P<0.05),其余则与PwA无明显差异(P>0.05)。结论 卫氏并殖吸虫抗原模拟表位对卫氏并殖吸虫病的诊断具有潜在的应用价值,有望代替天然抗原用于卫氏并殖吸虫病的诊断。     

抗丝虫成虫代谢抗原杂交瘤细胞株的建立与鉴定并应用Dot-ELISA检测人体淋巴丝虫病循环抗原

本文报道抗马来丝虫成虫代谢抗原(AWES_5)杂交瘤细胞株的建立与初步鉴定,AW-ES_5分泌的抗体针对成虫代谢抗原的McAb,并能与成虫抗原、成虫代谢抗原、微丝蚴抗原、犬恶丝虫抗原发生反应,具有科的特异性,与肺吸虫无交叉反应,与蛔虫抗原在低浓度时也无交叉反应,用马来丝虫成虫冰冻切片IFAT     

抗卫氏并殖吸虫单克隆抗体的筛选及其在诊断中的应用

本文报道测定16种抗卫氏并殖吸虫(Pw)囊蚴和成虫单克隆抗体(McAb)的同型及其交叉反应。其中,抗Pw成虫McAb A_3D_3为IgM,k型。应用Dot-ELISA方法,以McAb A_3D_3检测痰卵阳性患者21例和痰卵阴性疑似患者63例血清循环抗原(CAg)),结果痰卵阳性患者CAg阳性率为100％(21/21),痰卵阴性疑似患者CAg阳性率为85.7％(54/63);同法检测45例日本血吸虫病、55例华支睾吸虫病、24例丝虫病、49例肠线虫感染、31例肺结核患者以及93例健康人对照血清均为阴性。结果表明,McAb A_3D_3的特异性及敏感性强,因而在Pw活动性感染和Pw病的早期诊断上均具有应用和推广前景。     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

间日疟原虫与异种疟原虫之间的红内期交叉反应抗原分析

本文用1％NP－40分别提取间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、伯氏疟原虫及约氏疟原虫红内期可溶性抗原，用间日疟病人血清及两株抗间日疟红内期原虫单克隆抗体6H7和2C3对上述抗原进行免疫印迹分析。结果表明，间日疟原虫与异种疟原虫之间有一系列交叉反应抗原，其中食蟹猴疟原虫有14条蛋白带可被间日疟病人血清识别，多于另外三种疟原虫。五种疟原虫共有的79kD蛋白均可被间日疫病人血清识别。此外，间日疟病人血清还识别正常人红细胞膜抗原中的160kD、67kD蛋白带。McAb6H7识别不同疟原虫中相应的交叉反应抗原区带分别为：恶性疟原虫186kD、175kD；食蟹猴疟原虫133kD；伯氏疟原虫186kD、175kD及约氏疟原虫164kD，另外，McAb6H7还识别正常人红细胞膜中的184kD、170kD蛋白。McAb2C3识别四种疟原虫共有的60kD蛋白，该蛋白可能为疟原虫的种间共同抗原。     

斯氏狸殖吸虫抗原分析和血清学诊断方法的研究

[目的 ]分析斯氏狸殖吸虫囊蚴、童虫和成虫各期抗原和建立特异性抗原的斯氏狸殖吸虫病血清学诊断方法。 [方法 ]用SDS PAGE分离斯氏狸殖吸虫的各虫期抗原 ,经免疫印迹识别成虫期特异性诊断抗原。采用电洗脱技术分离 10～ 30kDa蛋白组分 ,建立纯化抗原的dot ELISA血清学诊断斯氏狸殖吸虫病。 [结果 ]斯氏狸殖吸虫病患者血清与成虫抗原的 10～ 30kDa显示较多免疫识别带 ,主带为 2 2、2 4和 2 6kDa。与血吸虫病和华支睾吸虫病患者血清的交叉反应带出现于 6 0～ 90kDa。斯氏狸殖吸虫成虫 10～ 30kDa抗原的dot ELISA与成虫粗抗原的ELISA检测 2 8例疑诊病人血清 ,两法阳性率间差异无显著性。而检测 38例感染其它吸虫和肺部疾病患者血清 ,粗抗原的ELISA交叉反应率为 13 2 % (5 /38)。 [结论 ]斯氏狸殖吸虫成虫 10～ 30kDa抗原的dot ELISA为斯氏狸殖吸虫病高度特异和敏感的血清学诊断方法。     

旋毛虫幼虫排泄分泌抗原中48kD蛋白的化学及免疫化学分析

用生理盐水培养旋毛虫肌肉期幼虫，２４小时后收集上清，从中获得排泄分泌抗原（ＴｓＬ－ＥＳＡ）．经用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，过碘酸银染，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ，单克隆抗体２Ｇ８Ｂ１０Ａ３、２Ｅ５Ｆ１１Ａ３识别和酶免疫组化定位等方法分析ＥＳＡ中４８ｋＤ蛋白组份．结果显示该蛋白为糖蛋白，能被２Ｅ５Ｆ１１Ａ３及２Ｇ８Ｂ１０Ａ３所识别，并定位于旋毛虫肌肉期幼虫角皮和杆状体．而２Ｅ５Ｆ１１Ａ３及２Ｇ８Ｂ１０Ａ３均不能识别犬弓首线虫幼虫、人钩蚴、蛔虫幼虫可溶性抗原及肺吸虫、姜片虫、血吸虫成虫可溶性抗原．实验表明４８ｋＤ蛋白组份为旋毛虫特有，是一种特异性较强的抗原．     

应用卫氏并殖吸虫成虫单克隆抗体检测感染犬循环抗原动态

本研究应用Dot-ELISA方法,以卫氏并殖吸虫(Pw)成虫单克隆抗体A_3D_3(McAbA_3D_3)检测5只实验感染犬吡喹酮治疗前后血清循环抗原(CAg)动态。结果表明,检出CAg最早时间为感染后第4d,至第19d,4只犬CAg检测均为阳性。感染后第101d,其中2只以吡喹酮总量3.2g进行治疗,治疗后短期内CAg滴度明显升高,至治疗后第6d达高峰,1号犬和3号犬分别在治疗后第65d和26dCAg滴度下降为0。2只未治疗感染犬CAg滴度维持于1:160～1:640。治疗后80d剖检2只治疗犬,其肺部均有多个陈旧性虫囊,内多为变性坏死虫卵,未发现虫体。未治疗犬于死后解剖获成虫60条。上述研究结果提示用McAbA_3D_3作Dot-ELISA对犬的Pw活动性感染具有早期诊断和疗效考核价值。     

Preparation of monoclonal antibody against Angiostrongylus cantonensis antigen

Monoclonal antibodies (MAb) against A cantonensis were produced through fusion of immunised spleen cells from BALB/c mice with NS-1 myeloma cells at a ratio of 10:1. The successful fusion rate on the 3rd day of fusion was 90.1%. Ten MAb were characterised, six of which were IgG1 and the remaining four were IgG2a, IgG2b, IgM and IgA respectively. Among 6 IgG1 MAb, four were A. cantonensis-specific, of which three reacted to adult worm antigen only and one reacted to both adult worm and juvenile worm antigens. Two other IgG1 MAb showed cross-reaction with other helminthic antigens of Toxocara canis. Ascaris suum. Paragonimus westermani, Dirofilaria immitis, Anisakis Spp, Gnatostoma Spinigerum and Clonorchis sinensis.     

用单克隆抗体鉴定恶性疟原虫裂殖子表面抗原

用海南省恶性疟原虫Fcc7801/HN作为抗原,制备的抗恶性疟原虫单克隆抗体C6株具有明显的抑制体外恶性疟原虫生长的作用,并且与恶性疟原虫Fcc-1/HN,Fcc7802/HN,Fcc8703/JS和伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫有较广泛的交叉免疫荧光反应。用免疫电镜观察,此株单克隆抗体能识别恶性疟原虫裂殖子表面抗原,用免疫印迹法测得该抗原分子量为71kDa,此抗原有可能成为疟疾疫苗的候选抗原。