GSK-3β特异的siRNA腺病毒对高脂诱导内皮细胞GSK-3β表达的影响

目的构建糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒,观察其抑制高游离脂肪酸(FFA)诱导下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)GSK-3β的表达情况。方法利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑以实验法测定病毒滴度。GSK-3β特异的siRNA腺病毒感染HUVEC,以Western印记法测定其对GSK-3β蛋白表达的影响。结果成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒,获得高滴度的腺病毒液;构建的重组腺病毒感染HUVEC,可显著抑制正常培养及游离脂肪酸诱导下的细胞的GSK-3β蛋白的表达,Ad-DEST组与Ad-640组比较,Ad-640组明显下降(P0.05)。结论构建的GSK3β特异的RNAi腺病毒能有效抑制HUVECGSK-3β蛋白的表达,有可能保护高脂诱导的HUVEC损伤。     

应用RNA干扰技术研究游离脂肪酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术探讨游离脂肪酸(FFA)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法 利用体外同源重组技术构建糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的siRNA腺病毒表达载体,在人胚胎肾293A细胞中包装并扩增病毒,应用空斑实验法测定病毒滴度.选用GsK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,采用Western blot方法检测其对GSK-3β和β-catenin 蛋白水平的影响.FFA贮存液按油酸盐:棕榈酸盐2:1配制,RNAi腺病毒和FFA共同干预HUVEC,采用流式细胞术、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.实验分为0.75 mmol/L FFA组、GSK-3β特异性RNAi腺病毒(Ad-640)+FFA组、未重组RNAi腺病毒(Ad-DEST)+FFA组、正常细胞组.采用方差分析进行数据比较.结果 构建的RNAi腺病毒感染HUVEC可以显著抑制GSK-3β蛋白的表达,上调细胞内β-catenin蛋白水平.0.75 mmol/L FFA具有促进细胞凋亡率的作用,荧光染色可见细胞出现典型的凋亡形态学改变;Ad-640+0.75 mmol/L FFA组与0.75 mmol/L FFA组(F=26.42,P<0.01)及Ad-DEST+0.75 mmol/L FFA组(F=23.34,P<0.01)相比细胞凋亡率显著减少,凋亡形态学改变亦明显减少,而Ad-DEST+FFA组与FFA组细胞凋亡率无显著差异(F=5.56,P>0.05),凋亡形态学改变相似.结论 构建的CSK-3β特异性RNAi腺病毒对FFA作用下的HUVEC具有部分保护作用.     

用RNA干扰慢病毒研究Wnt/β-连环蛋白信号通路对小鼠胰岛β细胞增殖的影响

目的 构建β-连环蛋白特异的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,初步探讨Wnt/β-连环蛋白信号通路对小鼠胰岛β细胞增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,与辅助包装质粒一起在293 T淋巴细胞中包装并扩增病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度;RNAi慢病毒感染小鼠胰岛β细胞,实时PCR以及Western blot法检测其对β-连环蛋白表达的抑制效应;利用构建的RNAi慢病毒抑制β-连环蛋白表达,四甲基偶氮唑盐法检测小鼠胰岛β细胞增殖活性.组间比较采用方差分析(ANOVA).结果 成功构建了β-连环蛋白特异的RNAi慢病毒表达载体,获得的慢病毒滴度在5.0×10~8TU/ml左右;RNAi慢病毒在3 d后就能有效感染小鼠胰岛β细胞,5 d后使细胞内β-连环蛋白基因mRNA和相应蛋白的表达受到明显抑制;慢病毒感染小鼠胰岛β细胞后,细胞增殖率明显减少.结论 构建的目的RNAi慢病毒表达载体能有效抑制β-连环蛋白基因的表达;Wnt/β-连环蛋白信号通路在小鼠胰岛β细胞增殖中有重要影响.     

NF-κB/p65特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对p65表达的抑制效应

目的构建NF-κB p65亚基特异的RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体，并验证其对p65亚基的基因沉默效应。方法设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的短发夹RNA（shRNA）编码序列，克隆到穿梭载体中，通过体外同源重组将短干扰RNA（siRNA）表达盒转移到腺病毒骨架质粒，构建RNAi腺病毒表达载体；在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定；腺病毒感染人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞，Western印迹法和免疫细胞化学法验证构建的RNAi腺病毒对p65蛋白表达的抑制效应。结果成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体，获得高滴度的腺病毒液；RNAi腺病毒感染ECV304细胞后可以高效抑制p65蛋白的表达，且对p65蛋白表达的抑制作用可持续6d以上。结论应用RNAi腺病毒表达载体能有效阻断目的基因的表达。     

SOX1过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生

目的 探索SOX1过表达对食管癌细胞增殖及凋亡的作用及其机制。方法 构建SOX1过表达细胞株，检测SOX1 mRNA和蛋白表达，CCK-8检测细胞增殖，细胞划痕及结晶紫染色检测细胞的迁移及克隆形成能力，Hochest染色实验检测细胞凋亡情况，Western blotting检测GSK-3β及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平。结果 SOX1过表达组mRNA显著高于对照组(P<0.01)。CCK-8 OD值及增殖曲线绘制表明SOX1过表达组增殖速率显著降低(P<0.05);SOX1过表达组细胞的迁移速率和克隆形成能力明显下降(P<0.05);显微镜下观察到SOX1过表达组细胞的皱缩明显，提示凋亡的发生；Western blotting检测结果表明，SOX1过表达组GSK-3β上调，Wnt信号通路相关基因β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 SOX1通过抑制Wnt/β-catenin信号传导抑制食管癌细胞的增殖和促进凋亡。     

阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路的干预作用

目的探讨阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路的干预作用。方法 36只SD大鼠,随机分为假手术组、模型组和阿托伐他汀组,各组分别设7 d、14 d两个时间点。HE、Masson、PAS染色法观察肾脏病理改变;免疫组化观察Wnt4和β-catenin蛋白在肾组织的表达;Western印迹检测各组大鼠肾皮质Wnt4、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Ecadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白的相对表达量。结果与假手术组相比,模型组肾皮质Wnt4和β-catenin、p-GSK-3β、α-SMA蛋白表达显著增多(P<0.05),CollagenⅠ沉积增多(P<0.01),E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.01),GSK-3β在各组大鼠肾组织表达无差异;与模型组相比,阿托伐他汀组肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β和α-SMA蛋白表达减少(P<0.05),CollagenⅠ蛋白沉积显著减少(P<0.05),并伴有E-cadherin蛋白表达显著增多(P<0.05),而GSK-3β蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论 Wnt4/β-catenin信号通路的活化促进了UUO大鼠肾脏纤维化的发生发展,阿托伐他汀能改善肾脏纤维化病变,减轻肾间质细胞外基质的沉积,可能与其抑制Wnt4/β-catenin信号通路的激活和传导有关。     

急性脑缺血再灌注大鼠海马CA1区细胞凋亡与β-catenin、GSK-3β蛋白表达的关系

目的探讨急性脑缺血再灌注(IR)大鼠海马CA1区细胞凋亡与Wnt信号通路β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表达的关系。方法选择雄性SD大鼠36只,随机分为假手术组6只、脑IR组30只,脑IR组又分为IR后3、6、24、48、72 h各6只,采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。应用原位末端标记法检测各组细胞凋亡情况,免疫组化法及Western blotting蛋白印记法分别检测β-catenin、GSK-3β蛋白表达;并对IR组的β-catenin、GSK-3β蛋白表达与细胞凋亡进行相关性分析。结果与假手术组比较,IR组各时间点细胞凋亡数、GSK-3β蛋白阳性数及β-catenin蛋白表达量明显增加(P均<0.01),β-catenin蛋白阳性数、GSK-3β蛋白表达量增加,但无统计学意义(P均>0.05)。脑IR后不同时间点的细胞凋亡数与GSK-3β蛋白阳性数呈正相关(P<0.05),与β-catenin蛋白阳性数无相关性(P>0.05)。结论 Wnt信号通路在脑IR组损伤中可能发挥重要作用,GSK-3β蛋白对缺血性脑损伤的细胞凋亡起促进作用。     

大鼠CD47 RNAi腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定大鼠CD47 RNAi腺病毒载体,制备具有一定滴度含CD47 RNAi基因的重组腺病毒,为后期研究CD47 RNAi在慢性心力衰竭中的作用及其分子机制奠定基础。方法:根据大鼠CD47基因序列,设计并合成3对CD47基因的特异性小干扰RNA(siRNA),合成互补的寡核苷酸链,构建大鼠CD47 RNAi腺病毒载体,并对目的基因进行鉴定。通过脂质体2000介导CD47 RNAi腺病毒载体和包装质粒共转染人HEK293细胞,以得到重组腺病毒,对其进行扩增、纯化及滴度测定。结果:成功构建了大鼠CD47 RNAi腺病毒载体。经重组腺病毒扩增与纯化,测得最终获得的重组腺病毒滴度为1×10~(11) PFU/ml。结论:成功构建获得了具有一定滴度含CD47 RNAi基因的重组腺病毒,为后期顺利开展有关CD47 RNAi在大鼠慢性心力衰竭中的作用及分子机制研究提供了研究基础。     

S1PR2通过抑制AKT/GSK-3β减少高糖诱导的内皮增殖

目的通过下调1-磷酸鞘氨醇2受体(S1PR2),观察其对体外高糖培养的脐静脉内皮细胞增殖的影响并探讨其通路。方法体外培养脐静脉内皮细胞,加入30 mmol/L的D-葡萄糖干预72 h后,检测S1PR2受体变化,内皮增殖情况,通过下调S1PR2后,查看S1PR2影响内皮增殖的可能通路。结果与正常组细胞相比,高糖组内皮细胞存活率降低,S1PR2表达增加,p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin、cyclin D1表达降低;通过在高糖干预的内皮细胞中加入S1PR2特异性拮抗剂(JTE-013)后,与高糖组相比,内皮细胞存活率增加,p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin、cyclin D1表达增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 S1PR2参与高糖诱导的内皮细胞增殖,其通路可能与AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1相关。     

肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin信号通路对6-HODA致帕金森病大鼠的神经保护作用

目的探讨肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致帕金森病大鼠受损神经的保护作用。方法将45只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和肉苁蓉多糖治疗组,采用6-HODA立体定向微量注射制备帕金森病大鼠模型。第32天观察实验动物行为学改变,之后将大鼠处死,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin蛋白表达;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)mRNA表达。结果与假手术组比较,模型组游泳静止时间缩短,自主活动站立次数下降,肉苁蓉多糖治疗后上述两种行为得到恢复;模型组脑黑质内Wnt1、β-catenin蛋白水平低于假手术组;肉苁蓉多糖治疗组脑黑质内Wnt1、β-catenin蛋白水平高于模型组(P0.05);模型组脑黑质内GSK-3βmRNA高于假手术组;肉苁蓉多糖治疗后,帕金森病大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA水平下降(P0.05)。结论肉苁蓉多糖能改善6-HODA所致帕金森病SD大鼠模型临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制GSK-3β活性,进而发挥多巴胺神经保护作用。     

姜黄素调控食管癌Eca-109细胞分化、增殖、凋亡的机制

目的探讨姜黄素对食管癌Eca-109细胞的分化、增殖、凋亡及分泌信号蛋白(Wnt)信号通路的影响及机制。方法 MTT法检测8、16、32、64μmol/L的姜黄素作用于食管癌Eca-109细胞24、48、72 h后细胞存活情况,计算细胞凋亡率,原位末端标记法(TUNEL)检测48 h后细胞凋亡情况,RT-PCR检测48 h后细胞中β连环蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc的mRNA的表达情况,Western印迹检测48 h后细胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc蛋白的表达情况。结果姜黄素对食管癌Eca-109细胞的抑制作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加,姜黄素作用24 h IC50为28.1μmol/L,48 h为23.2μmol/L,72 h为15.6μmol/L。TUNEL检测细胞凋亡率随着药物作用浓度的增加而增加。β-catenin、c-myc的转录水平随着药物浓度的增加而减弱。GSK-3β的转录水平随着药物浓度的增加而加强。β-catenin、c-myc蛋白表达量随着药物浓度的增加而减弱。GSK-3β蛋白表达水平随着药物浓度的增加而加强。结论姜黄素可以抑制食管癌Eca-109细胞增殖,促进细胞凋亡。姜黄素可以上调Wnt信号通路中GSK-3β酶的表达、促进β-catenin蛋白降解,从而抑制c-myc基因的转录,抑制癌细胞生长增殖。     

衰老对大鼠结肠干细胞增殖分化功能及微环境的影响

目的探讨衰老对大鼠结肠干细胞增殖分化功能及微环境的影响。方法雄性SD大鼠按不同月龄分成:成年组(6月龄)、老年组(24月龄),每组10只。采用高碘酸-雪夫试剂(PAS)染色和阿利新蓝染色检测大鼠结肠杯状细胞数量的变化,免疫组化检测各组大鼠结肠干细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白的表达,RT-PCR检测各组大鼠结肠干细胞MUC1、MUC2、Lgr5、Bmi-1的变化。结果与成年组比较,老年组大鼠结肠组织干细胞标记物Lgr5、Bmi-1 mRNA表达量显著降低(P0. 01),细胞增殖相关蛋白PCNA表达显著增加(P0. 01),杯状细胞数量和MUC1、MUC2 mRNA表达显著降低(P0. 01),其微环境Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin蛋白显著增加(P0. 05)、GSK-3β表达显著降低(P0. 01)。结论衰老过程中,大鼠结肠干细胞增殖功能增加,向杯状细胞分化的功能减弱,干细胞微环境Wnt/β-catenin信号通路上调。     

慢病毒介导的KIAA1199表达下调对肝癌HuH-7细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的研究慢病毒介导的KIAA1199表达下调对肝癌Hu H-7细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法肝癌Hu H-7细胞感染LV3-KIAA1199 shRNA慢病毒,qRT-PCR和Western blotting测定下调效果,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术测定细胞凋亡。Western blotting检测激活的Caspase-3(C-Caspase-3)、激活的Caspase-9(C-Caspase-9)、β-catenin、C-myc蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl处理感染LV3-KIAA1199 shRNA慢病毒的肝癌细胞,检测细胞增殖、凋亡变化。结果感染LV3-KIAA1199shRNA慢病毒的肝癌Hu H-7细胞中KIAA1199 mRNA和蛋白水平均下降,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9表达水平升高,β-catenin、C-myc蛋白表达水平下降。Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl可以逆转下调KIAA1199对肝癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用。结论慢病毒介导的KIAA1199表达下调通过阻断Wnt/β-catenin信号诱导肝癌Hu H-7细胞增殖抑制和凋亡增加。     

Kiss-1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌MKN-45细胞增殖、迁移能力的影响

目的探讨肿瘤抑制因子(Kiss)-1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法 qRT-PCR检测50例胃腺癌组织和对应的癌旁组织中Kiss-1水平。分别将Kiss-1小干扰RNA(siRNA Kiss-1)和对照小RNA(siRNA control)、Kiss-1过表达载体(p EGFP-N1-Kiss-1)和对照空载体(p EGFP-N1)转染至胃腺癌细胞株(MKN-45)中,培养48 h后,Western印迹检测细胞中Kiss-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc蛋白水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535作用胃腺癌细胞后,检测细胞增殖和凋亡情况。结果 Kiss-1在胃腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1组细胞存活率和迁移率显著低于p EGFP-N1组,siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(P<0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1组细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平显著低于p EGFP-N1组,siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(P<0.01)。抑制剂作用后的胃腺癌细胞增殖迁移趋势与p EGFP-N1-Kiss-1组一致。结论 Kiss-1在胃腺癌组织中低表达,Kiss-1通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃腺癌细胞增殖迁移能力。     

miR-183调控Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌SGC-7901细胞生物学特性的研究

背景 miR-183在胃癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中低表达,发挥抑癌基因的作用,但其在胃癌中作用机制目前尚不十分清楚.研究表明, miR-183可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭,而Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中高度激活与胃癌的发生和转移密切相关.但miR-183是否调节Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞生物学特性尚不清楚.目的探讨miR-183调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞生物学特性的影响.方法采用q RT-PCR检测miR-183在不同胃癌细胞株中的表达情况,在胃癌细胞SGC-7901中转染miR-183mimics或mimics对照,分别设为miR-183组和miR-NC组, qRT-PCR检测转染效率,噻唑蓝增殖实验检测SGC-7901细胞增殖变化,流式细胞仪检测SGC-7901细胞凋亡情况, Transwell实验检测SGC-7901细胞侵袭和迁移能力, Western blot法检测凋亡相关及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平.使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂氯化锂处理过表达miR-183的SGC-7901细胞,观察SGC-7901细胞生物学特性的变化.结果与正常胃黏膜上皮GES-1细胞相比, 4株胃癌细胞中miR-183的表达水平明显降低(P 0.05).转染miR-183mimics后SGC-7901细胞中miR-183的表达水平显著升高(P0.05).过表达miR-183后SGC-7901细胞OD值降低(P0.05),凋亡率、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P 0.05),侵袭和迁移细胞数减少(P0.05),β-catenin、p-GSK-3β和Cyclin D1蛋白表达水平下调(P0.05), GSK-3β蛋白表达水平上调(P 0.05).激活Wnt/β-catenin信号通路部分逆转了过表达miR-183对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用及凋亡促进作用(P0.05).结论miR-183可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路阻碍人胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力,促进细胞凋亡.     

核糖核酸干扰技术沉默大鼠心肌细胞核因子-κB p65表达的研究

目的:构建核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65亚基特异的核糖核酸干扰腺病毒表达载体,验证其对p65亚基的沉默效应。方法:设计针对大鼠NF-κB p65亚基的不同干扰序列,通过质粒将其导入腺病毒,感染大鼠心肌细胞(H9C2)。将感染后的心肌细胞通过RT-PCR方法和Western Blot方法检测各组NF-κB p65的基因水平表达和蛋白质水平表达。结果:成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染H9C2细胞后可以高效抑制NF-κB p65蛋白的表达。结论:RNAi技术能有效的沉默大鼠心肌细胞NF-κB p65的表达。     

腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞特异性表达的研究

目的观察构建的重组腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体(β2-AR)基因能否在心肌细胞中特异性表达.方法构建含心肌肌凝蛋白轻链(mlc-2v)启动子携带β2-AR基因的重组腺病毒载体(Admlcβ2-AR),用重组病毒感染大鼠心肌细胞、3T3细胞、HFCL细胞及HeLa细胞,检测感染的细胞中人β2-AR基因的表达.结果RT-PCR显示只有感染的心肌细胞表达人β2-ARrRNA;Westem免疫印迹杂交分析表明感染的心肌细胞有人β2-AR表达;放射性配基检测显示感染的心肌细胞β-AR密度(153±5.2)fmol/mg蛋白,明显高于未感染的心肌细胞(76±2.8)fmol/mg蛋白,P＜0.01).结论构建的重组腺病毒载体可有效地将β2-AR基因导入心肌细胞并使其特异性表达.     

高迁移率族蛋白A1在转化生长因子β诱导的人脐静脉内皮间质转化中的作用

目的研究高迁移率族蛋白(HMG)A1在转化生长因子β(TGF-β)诱导的人脐静脉内皮间质转化中的作用机制。方法选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)随机分组:(1)空白模型组和空白对照组,分别采用10 ng/ml的TGF-β和等体积PBS刺激72 h;(2)对照1组[携带绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV9-GFP)+PBS],HMGA1组(AAV9-HMGA1+PBS),模型1组(AAV9-GFP+TGF-β),实验1组(AAV9-HMGA1+TGF-β),各组细胞进行AAV9-HMGA1或AAV9-GFP转染后,给予TGF-β或PBS刺激72 h;(3)对照2组[阴性对照siRNA(si-NC)+PBS],si-HMGA1组[靶向HMGA1的小干扰RNA(si-HMGA1)+PBS],模型2组(si-NC+TGF-β),实验2组(si-HMGA1+TGF-β),各组细胞转染后,给予TGF-β或PBS刺激72 h。检测各组HMGA1、CD31、CD34、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、β连环蛋白(β-catenin)表达。结果与空白对照组比较,空白模型组HMGA1蛋白表达明显增加(0.33±0.03 vs 0.19±0.01,P0.05)。HMGA1组HMGA1蛋白表达水平明显高于对照1组(0.73±0.09 vs 0.19±0.02,P0.05)。与模型1组比较,实验1组HUVEC的CD31荧光强度明显减弱,波形蛋白荧光强度明显增强(P0.05)。与模型1组比较,实验1组CD31和CD34蛋白表达明显降低,α-SMA、波形蛋白及β-catenin表达显著上调(P0.05)。与对照2组比较,si-HMGA1组HMGA1蛋白表达明显下调(P0.05);与模型2组比较,实验2组CD31表达上调,α-SMA和β-catenin表达下调(P0.05)。结论 TGF-β可以诱导HUVEC的HMGA1表达上调,并且HMGA1通过Wnt/β-catenin信号通路促进内皮间质转化。     

Wnt/β-catenin信号通路可能调节胰腺癌细胞TBX2基因表达

目的探讨Wnt／β-catenin信号途径是否参与胰腺癌细胞中TBX2基因的表达调节。方法运用免疫细胞化学sP法，检测胰腺癌细胞株SW1990中是否有Tbx2和β-catenin蛋白表达；以不同浓度的糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的特异性抑制剂氯化锂作用于SW1990，应用RT-PCR检测TBX2基因及Wnt／β-catenin信号通路的已知靶基因c-myc的mRNA表达变化；Western印迹法检测β-catenin、Tbx2蛋白的表达变化。结果在SW1990细胞中有Tbx2和β-catenin蛋白表达；氯化锂作用于SW1990细胞后，TBX2、c-myc、β-catenin表达水平均升高（P〈0．05）；Tbx2蛋白随着β-catenin表达水平的升高而升高（r=0．583，P〈0．05）。结论Wnt／β-catenin信号通路可能参与了胰腺癌细胞中TBX2基因表达的调节。     

葛根素对H_2O_2诱导的颈椎间盘纤维环细胞凋亡的影响及机制

目的探讨葛根素对过氧化氢(H_2O_2)诱导颈椎间盘纤维环细胞凋亡的影响及机制。方法分离培养大鼠颈椎间盘纤维环原代细胞,将细胞分为对照组、H_2O_2组和葛根素组,氯化锂(LiCl)为Wnt信号通路激活剂。噻唑蓝(MTT)及流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针检测活性氧(ROS)水平。Western印迹检测Wnt1、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和Bax蛋白表达。结果与对照组比较,H_2O_2组细胞活力降低,凋亡率升高,ROS水平升高,Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P0.05)。与H_2O_2组比较,葛根素组细胞活力升高,凋亡率降低,ROS水平降低,Wnt1、β-catenin和GSK-3β的蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。葛根素+LiCl组细胞活力显著高于葛根素组,凋亡率显著低于葛根素组(P0.05)。结论葛根素可降低由H_2O_2诱导的颈椎间盘纤维环细胞凋亡,机制与细胞内ROS水平降低及激活Wnt信号通路有关。