寡核苷酸DNA微阵列用于人类白细胞抗原-DR53组基因分型的研究

目的 建立用于人类白细胞抗原(HLA)-DR53组基因分型的寡核苷酸DNA微阵列。方法 根据中国汉族人群HLA-DRB等位基因的频率设计特异性的分型探针,制作寡核苷酸DNA微阵列。通过组间特异引物扩增基因组DR153相应区段的DNA,扩增中用Cy5-dCTP荧光标记,扩增标记后的产物与芯片的探针杂交,通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品的基因亚型。分型结果用标准DNA和序列特异寡核苷酸探针杂交验证。结果 经寡核苷酸DNA微阵列分型,111份样本中共检出DR53组位点72个,其中DR9 34个,DR4 25个,DR7 13个,无一例假阳性或假阴性,重复率和准确率均达到100％。检测总耗时约5h。结论 寡核苷酸DNA微阵列用于HLA-DR53组基因分型具有高分辨率、高特异性和简单快速的特点,适合于临床应用。     

DNA芯片技术检测HLA-DR1,DR51组基因型

目的 采用DNA芯片技术对HLA—DRl，DR51组基因分型。方法 根据编码HLA—DR1，DR51组抗原等位基因序列设计特异分型探针，制作DNA分型芯片。通过组间特异引物扩增基因组相应区段DNA，扩增中用Cy5-dCTP荧光标记，扩增标记后的产物与芯片探针杂交，通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品基因亚型。分型结果用标准DNA和PCR—SSO验证。结果130份样本共检出HLA-DR1，DR51组位点34个，包括18个：DR15，8个DR16，6个：DR10，2个DR1，无假阳性或假阴性，准确率和重复率均达100％。检测总耗时约3．5h。结论 DNA芯片用于HLA-DR1、DR51组基因分型具有高分辨度、高特异性和简单快速的优点，适于器官移植临床应用。     

胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的制备和初步应用

目的探讨胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的构建,初步验证其在检测胰腺癌基因表达谱方面的应用。方法有目的地筛选胰腺癌相关基因,采用合成后点样的方法,制成寡核苷酸基因芯片。TRIzol法抽提组织总RNA,在cDNA第一链合成过程中,通过反转录酶将CyDye标记核苷酸直接掺入到eDNA中制备荧光探针,其中用Cy3-dCTP标记胰腺癌组织,cy5-dCTP标记正常胰腺组织。将荧光标记探针与芯片杂交16—18h。用Agilent扫描仪进行扫描,Imagene3．0软件进行图像分析,计算两种荧光Cy3与cy5信号强度的比值。挑选差异基因CDC25B和TUSC3进行荧光定量PCR（Sybrgreen方法）验证,PCR产物的定量方法采用比较Ct法。结果芯片杂交扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比,各阳性质控点信号均匀一致,阴性质控点和空白点信号低。与正常组织相比,胰腺癌组织中差异表达基因24条,占全部基因的25．5％,其中上调基因17条（18．1％）,下调基因7条（7．4％）。荧光定量PCR验证,CDC25B和TUSC3基因在胰腺癌中的表达趋势与芯片实验的结果一致。结论本研究制备的胰腺癌相关基因芯片可同时、并行检测多种胰腺癌相关基因的表达改变,具有一定的特异性和敏感性。胰腺癌组织与正常胰腺组织相比,基因表达谱具有明显差异。     

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术行快速HLA—DR53基因配型

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＲ）对６５例肾移植供受ＨＬＡ－ＤＲ５３组（ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ９）进行基因水平分型。结果本组有位点均分型成功，无一例假阳性和假阴性；每位点重复１０次，重复１００％；总耗时５小时。分型结果经标准细胞株、限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交予以确证，特异性１００％。显示本方法用于ＨＬＡ－ＤＲ５３组基因分型具有高分辨率、高特异性和简捷快速物特点，适合于临床应用     

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术行快速HLA－DR53组基因配型

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）对６５例肾移植供受者的ＨＬＡ－ＤＲ５３组（ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ９）进行基因水平分型。结果本组所有位点均分型成功，无一例假阳性和假阴性；每位点重复１０次，重复性１００％；总耗时５小时。分型结果经标准细胞株、限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交予以确证，特异性１００％。显示本方法用于ＨＬＡ－ＤＲ５３组基因分型具有高分辨率、高特异性和简捷快速的特点，适合于临床应用。     

发囊基因芯片法和血样单克隆抗体法在HLA-Ⅱ类分型中的比较研究

目的 同步双盲法研究单克隆抗体法和基因芯片法在HLA分型中的准确性、重复性和实用性。方法 研究样本46份，单克隆抗体法采用一步法单抗分型技术，基因芯片法采用寡核苷酸芯片技术。结果 46份标本的单克隆抗体法和基因芯片法分型成功，对有差异的结果进行基因芯片法复查，重复率100％。单克隆抗体法耗时1.5h，基因芯片法耗时3.5h。基因芯片法的漏检率低于单克隆抗体法。两种方法主要在对DR2(DR15，DR16)的检测结果上不一致。结论 目前HLA-Ⅱ类抗原的分型，尤其是临床大样本分型，可以采用单克隆抗体分型技术进行快速分型。对于要求精细配型的骨髓移植，应该采用基因芯片分型或其他DNA分型技术。对于单克隆抗体分型结果可疑的样本应用基因芯片分型确认。     

基因芯片技术在男性生殖研究中的应用

基因芯片是应用大规模集成电路的微阵列技术,在固相支持物表面有规律地将数万个代表不同基因的寡核苷酸探针或液相合成探针,由点阵器有规律地点样于固相支持物表面。实验研究时将材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素或荧光物标记,与固相支持物表面的探针进行杂交,通过荧光共聚焦显微镜扫描,利用计算机对每一个探针上的杂交信号作检测、分析,从而检测目的材料中大量基因表达图谱。该技术可将     

荧光定量分型法在HLA-DRB1位点分型中的应用

目的：探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)分型方法在HLA分型中的应用价值。方法：在低分辨SSP法基础上，加入荧光探针，建立HLA-DR位点荧光定量分型法，对46例标本进行分型。结果：46例样本分型均成功。与SSP结果完全相同，与血清学分型结果比较，以DR位点单体型计算，符合率66.3％（61/92），两个等位基因型与血清学结果完全相符者43.5％（20/46）。结论：荧光定量分型法可提高自动化程度，减少污染机会，简化操作。与血清法相比，准确性提高。     

HLA-DR、HLA-DQ分子在瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中的变化

目的探讨瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)HLA-DR和HLA-DQ分子的含量及其基因型的变化.方法采用免疫细胞化学方法检测10例瘢痕疙瘩患者、10例扁平瘢痕患者及10例正常人外周血单个核怂细胞中HLA-DR、HLA-DQ分子的含量;应用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)方法检测60例瘢痕疙瘩患者和110例正常人外周血单个核细胞HLA-DR和HLA-DQ的基因位点.结果①瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞HLA-DR、HLA-DQ分子含量的变化瘢痕疙瘩组HLA-DR 、HLA-DQ 细胞的积分光密度(813.16±62.77,420.12±94.25)高于扁平瘢痕组(636.22±1 33.95,302.77±89.77)和正常人组(597.88±166.36,308.57±44.05)(P＜0.01);②瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中HLA-DR和HLA-DQ基因位点的变化瘢痕疙瘩组HLA-DR14和HLA-DQ5位点的抗原频率(0.16,0.28)明显高于对照组(0.06,0.15)(P＜0.05),HLA-DR17和HLA-DQ8位点的抗原频率(0.02,0.03)明显低于对照组(0.13,0.15)(P＜0.05).结论HLA-DR和HLA-DQ分子含量在瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中增高提示瘢痕疙瘩患者机体可能处于高免疫应答状态;基因型检测结果则提示HLA-DR14、HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因,HLA-DR17、HLA-DQ8可能是抵抗基因.     

高通量水凝胶芯片检测Y染色体微缺失方法的建立

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、低成本的通用水凝胶芯片检测平台,用于临床筛查Y染色体微缺失。方法:以含公用序列的特异性延伸引物对检测位点进行延伸,延伸过程中Cy5-dUTP的掺入使产物被标记上荧光,再与丙烯酰胺修饰公用探针杂交将延伸产物固定于水凝胶芯片上,电泳去除游离的Cy5-dUTP后进行荧光扫描分析,并优化水凝胶芯片检测方法的条件。结果:采用水凝胶芯片检测方法对9例样本的SY254位点检测,检测结果为3例正常,6例微缺失(1例女性样本作为阴性对照),与传统的PCR-电泳检测结果一致。结论:初步建立了一种检测微缺失的水凝胶芯片平台,为Y染色体微缺失的诊断提供了新技术,提高了男性不育的诊疗水平。     

基因芯片技术在肾移植组织配型中的应用

目的比较基因芯片和特异性聚合酶链反应(PCRSSP)两种HLADR分型方法,探讨适用于肾移植供、受者分型的新方法。方法对60份肾移植供、受者的DNA样本同时采用基因芯片和PCRSSP进行HLADR分型,并进行分析比较。结果60例样本的两种分型方法结果完全一致56份,相同率达93%。结果不相同的样本共4份,经第三方验证,其中基因芯片分型漏1个位点2例、1个位点误判1例,PCRSSP分型漏1个位点1例。其中20份样本作了重复实验,其重复率达到96%。结论基因芯片用于HLA分型具有灵敏度高、效率高、标准化程度高的优点,是其它分型方法所无可比拟的,具有广阔的应用前景。     

PCR－SSP快速HLA－DR52组基因分型与临床应用

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）对６５例肾移植供受者ＨＬＡ－ＤＲ５２组基因分型，同时与血清学方法对比研究。显示血清学方法错误率高达３６％；而ＰＣＲ－ＳＳＰ分型全部成功，无一例假阳性和假阴性；重复性１００％，总耗时５小时。分型结果经标准细胞株、限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交等确证，特异性达１００％。结果表明：ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＤＲ５２组基因分型，快速、特异，结果可靠，适合于临床应用。     

套式序列特异引物聚合酶链反应技术的建立及其在HLA配型中的应用

磁式序列特异引物聚合酶链反应方法，用于ＨＬＡ－ＤＲ基因分型。利用一对外引物扩增ＨＬＡ－ＤＲＢ１第２外显子部分片段，作为第２次扩增的模板，ＰＣＲ循环参数；     

HLA-Ⅰ、Ⅱ类PCR-SSP基因分型在肾移植配型及亲子鉴定中的应用

目的：建立快速、准确的HLA基因分型方法,满足临床移植配型的需要。方法：对21对已进行HLA抗原血清学分型的肾移植的供、受者,12例亲子鉴定应用聚合酶链反应－序列特异引物（PCR－SSP）进行HLA－I、Ⅱ类基因A、B、DRB、DQB1位点扩增,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并确定其基因型。结果：基因分型结果与血清学分型一致者有18对,基因分型能明确判断而血清学分型无法判断者有3对;排除亲子关系的有两例。结论：PCR－SSP方法具有操作简单、快速、结果可靠的特点,不仅适用于移植配型、法医学亲子鉴定和个人识别,也可用于相关疾病及人类遗传学的研究。     

参照链介导的构象分析策略在HLA-B位点分型中的临床应用研究

目的建立并稳定HLAB位点的参照链介导的构象分析(RSCA)系统,并鉴定RSCA分型策略的优势。方法提取27例造血干细胞移植患者及63名供者的外周血DNA,采用RSCA进行HLAB位点分型,并与序列特异性引物聚合酶链反应技术(PCRSSP)分型结果进行比较,对于疑难标本采用测序鉴定。结果在90份标本中,87份(96.7%)可明确判定结果,其中有1份标本与PCRSSP结果不一致,经测序鉴定RSCA结果正确;67份(74.4%)可直接指定等位基因型别。此外,1份标本(1.1%)因PCR扩增结果太弱而未能获得RSCA分型结果,2份标本只能确定1条等位基因,经测序发现另1条等位基因为已知等位基因,但RSCA数据库中没有其数据。随机选择20份标本进行RSCA重复性实验,重复率为100%。在PCRSSP方法分型中,约有10%的标本需要重复1～3次方能判定结果。结论RSCA具有灵敏、特异、分辨率高、重复性好、可发现变异基因及新的等位基因、大规模和低成本等优点,适用于大规模的无关移植供、受者的选择。     

人类白细胞抗原DR基因与狼疮性肾炎相关性的探讨

目的 从基因水平探讨人类白细胞DR抗原(HLA-DR)基因与中国北方汉人狼疮性肾炎(LN)的相关性。方法 采用特异性引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)方法,检测89例系统性红斑狼疮(SLE)患者及106例健康者HLA-DRB1基因类型,进行临床相关性分析。结果 SLE患者的HLA-DR2及DR9基因频率明显高于对照组(0.36/0.20,RR=2.36,P<0.001;0.27/0.18,RR=1.69,P<0.05);DR2及DR9同时阳性的35例患者中,LN的发病率明显高于其它患者(RR=4.93,P<0.005),而且抗dsDNA抗体的阳性率也较高(RR=2.66,P<0.05)。结论 中国汉人HLA-DR2及DR9基因可能与SLE的遗传易感性有关,两者有相加作用,DR2及DR9同时阳性的SLE患者易患LN。     

HLA-DR antigen and HLA-DRB1 genotyping with nonobstructive azoospermia in Japan.

We previously reported that the HLA-A33, -B13, and -B44 antigens, which are major histocompatibility complex class I molecules, are involved in the susceptibility of nonobstructive azoospermia in Japanese men. In this report, HLA-DR antigens, which are class II molecules, are investigated by advanced DNA typing in addition to classical serological typing to study a more complex genotype of HLA-DRB2. Genotyping was performed by the polymerase chain reaction-sequence-specific primer (PCR-SSP) method of analysis and/or by a commercial rapid assay based on the polymerase chain reaction (PCR), followed by reverse dot-blot hybridization of PCR products (the Inno-LiPA assay). The allele frequencies of the HLA-DR13 antigen and the -DRB1*1302 allele were significantly higher in Japanese subjects with nonobstructive azoospermia compared with a control group of healthy Japanese men, and these alleles were associated with relative risks for nonobstructive azoospermia of 4.2 and 4.9, respectively. If we suppose this strong linkage to both HLA class I and II antigens is due to linkage disequilibrium, it may suggest the existence of a novel gene involved in spermatogenesis in the class III region, which is located between the class I and class II regions and contains several genes other than HLA.