鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株91001的全基因组序列,并通过比较基因组学研究,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定91001菌株的全基因组序列,利用比较基因组方法对91001与另外2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 91001菌株的基因组包括1条染色体和4个质粒(pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为9609bp,与参考菌株基本一致;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒,长度为70159bp,编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒长度为106642bp,保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒,在国内外研究中未曾报道,这一质粒长度为21742bp,具有独立复制能力,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4595065bp,有4037个编码序列(CDS),其中141个是假基因;染色体中存在着非常丰富的插入序列,由于存在IS序列介导的基因组重排,91001菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析,初步确定了91001菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉伯糖分解代谢阴性以及蜜二糖分解阳性的遗传基础。结论 根据质粒结构、染色体基因组重排、硝酸盐还原阴性的机制以及假基因的分布等信息,推测以91001菌株为代表的田鼠型菌株是原始鼠疫耶尔森菌进化过程中的另一个分支,与现有菌株存在着比较明显的差异;而91001菌株独特的致病性可能与基因组中的假基因或大片段缺失有关。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究

目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异。结果成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白。结论利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索。     

温度对粘质沙雷菌蛋白质表达谱的影响

目的:研究粘质沙雷菌在不同温度下蛋白表达谱的差异,为探讨温度对生理特性和代谢产物的影响奠定基础.方法:采用双向电泳技术对25℃/37℃培养的粘质沙雷菌蛋白表达谱进行了比较和分析,差异蛋白点经过胶内酶切后进行MALDI-TOF质谱鉴定,所得到的肽指纹图谱用Mascot进行检索.结果与结论:共鉴定到31个差异点对应于23种蛋白.其中,S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达在37℃下调,给出了有关灵菌红素生物合成的新证据;此外,研究还发现,鲱精胺酶在37℃表达上调,提示粘质沙雷菌精氨酸代谢可能会随温度发生改变.     

温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控研究

目的研究温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控作用。方法首先设计相关跨基因引物,用RT-PCR方法验证psa位点的相关操纵子结构。扩增操纵子首基因上游启动子区500 nt序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,将重组质粒转入鼠疫菌中,通过测定β-半乳糖苷酶活性差异来判断不同温度（26和37℃）和酸度（pH 6.0和pH 8.0）对psaE和psaA的调控关系。最后提取鼠疫菌在上述不同温度和酸度条件下的总RNA,采用引物延伸实验进一步明确温度和酸度对psaA的调控关系。结果与结论 RT-PCR结果证实了田鼠型鼠疫菌的psa位点由操纵子psaEF和psaABC构成;半乳糖苷酶和引物延伸实验结果显示在37℃、pH 6.0培养条件下psaABC的转录水平最高,而psaEF的转录水平无明显变化,提示psaA的表达水平在37℃酸性条件下表达量最高,psaE则不受温度和酸度的调控。     

口服福氏2a志贺氏菌T32菌苗株减毒基础分析

福氏2a志贺氏菌(下简称F2a)T32菌苗株,其质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳表明,具有志贺氏菌属共有的约120～140Mdal大小的质粒.DNA探针杂交试验证明,T32株与志贺氏菌属侵入有关的17kb或4.1kbDNA探针没有同源性.免疫印迹技术显示,T32株不表达侵袭性4种外膜蛋白(a,b,c和d).当将宋内氏志贺氏菌毒株I相大质粒诱动转移到T32株时,它又回复了侵入上皮细胞并引起豚鼠眼角膜结膜炎的能力.上述事实揭示,T32株的减毒基础在于140Mdal大质粒上与侵入有关的某些基因片段的缺失突变,而与毒力有关的染色体上的基因片段并未发生改变.     

弗氏2a志贺菌CobB和GtrⅡ蛋白水平及毒力相关性的初步研究

目的研究翻译后修饰基因cobB和gtrⅡ对志贺菌致病能力的影响。方法采用λ-Red重组系统构建福氏2a志贺菌2457T的cobB,gtrⅡ缺失突变株,进行初步的毒力评价,随后制备野生株,cobB,gtrⅡ缺失突变株的全菌蛋白样品,并进行双向电泳比较野生株和缺失株在蛋白表达谱上的差异。结果成功构建cobB、gtrⅡ基因的缺失突变株,豚鼠角膜实验发现cobB、gtrⅡ缺失株症状稍弱于野生株,但在全菌蛋白表达谱中野生株和突变株并无明显差异。结论双向电泳难以有效地呈现CobB和GtrⅡ的翻译后修饰能力。     

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

宋内氏志贺氏菌和伤寒Ty21a(gal E)二价杂交株的构建

本文用转座子Tn5标记宋内氏菌Ⅰ相大质粒,然后经诱动质粒R386将宋内氏菌Ⅰ相大质粒转移到受体菌伤寒Ty21a菌苗株内,使宋内氏菌编码的Ⅰ相(O)抗原在Ty21a株内得到表达,获得二价抗原杂交株Ts-1株。     

弗氏志贺菌2aphoNl基因功能的初步研究

目的：初步探讨phoN1基因在志贺菌属中的功能。方法使用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株phoN1缺失突变株,通过比较蛋白质组学方法研究突变株与野生株的蛋白表达谱差异,并利用豚鼠角膜炎模型、HeLa细胞竞争侵袭实验评价两者之间的毒力差异。结果成功构建了phoN1缺失突变株,蛋白质学研究发现, phoN1缺失对其他胞内蛋白无显著影响,豚鼠角膜实验和HeLa细胞竞争侵袭实验证实,phoN1缺失不影响志贺菌属的侵袭能力。结论 phoN1在体外生存、侵袭宿主细胞过程中未发挥显著作用,其功能有待进一步研究。     

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法以芯片比较基因组杂交为主要研究手段,结合PCR验证,对19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。     

志贺菌rfbA基因突变体的构建

目的构建弗氏2a志贺菌301 rfbA基因缺失突变株,初步探究志贺菌脂多糖合成与糖蛋白合成通路是否相关。方法首先用PCR扩增出rfbA基因上下游同源臂,构建含有kan基因的打靶片段,采用λ-Red重组系统对rfbA基因进行缺失,用PCR进行初步验证,然后通过LPS的银染方法进行进一步验证。随后,制备野生株、rfbA缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株301和rfbA缺失株的蛋白表达谱。结果成功构建了301 rfbA缺失突变株。在LPS的银染实验中,rfbA突变株在凝胶中未形成一长串的梯状条带。在双向电泳实验中,野生株和突变株没有明显的蛋白差异点。结论获得了301 rfbA基因缺失突变体,初步认为志贺菌中不存在与脂多糖O-抗原合成相关的蛋白糖基化途径。     

外源性PTEN基因体外转染C6胶质母细胞瘤株及稳定表达蛋白产物的鉴定

目的 探讨外源性PTEN抑癌基因转染胶质母细胞瘤株并表达活性蛋白产物的可行性.方法 对获赠的包含有人PTENcDNA全长序列的PRK-PTEN质粒进行扩增和酶切鉴定后,用脂质体介导PRK-PTEN质粒转染大鼠C6胶质母细胞瘤株,荧光染色检测转染细胞中PRK-PTEN质粒携带的绿色蛋白荧光报告基因,免疫组化染色鉴定稳定转染后C6细胞中PTEN功能蛋白.结果 转染后的C6胶质母细胞瘤株稳定表达绿色荧光蛋白和PTEN功能蛋白.结论 PRK-PTEN质粒载体在脂质体的介导下可以将PTEN基因整合到C6胶质母细胞瘤的基因序列中去,并且通过宿主基因序列的表达稳定地产生PTEN功能蛋白,为以PTEN基因为靶点的胶质瘤基因治疗提供了实验理论依据.     

结核分枝杆菌利福平依赖株与耐受株差异蛋白的筛选与鉴定

%.依赖株表达量显著上调的蛋白质点7个,明显低表达的35个,单独表达的5个,缺如表达的6个,多为小分子蛋白质.在差异表达蛋白质中初步筛选了10个蛋白斑点进行质谱鉴定,9个蛋白斑点被鉴定,代表7种蛋白质.结论 结核分枝杆菌利福平依赖株可能主要通过脂肪酸生物合成和能量代谢相关酶类的差异表达,从而表现出迅速和旺盛的生长特点.     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

人PD-L1胞外区基因的克隆、原核表达及抗体制备

目的 克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础.方法 用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用His抗体为一抗进行Western blotting鉴定并验证结合活性.用纯化的hPD-L1胞外区蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达质粒pET28a(+)-hPD-L1成功构建,并可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导高效表达,得到的hPD-L1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确.用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度可达105.结论 鉴定和纯化了原核表达的hPD-L1蛋白,制备的相应多克隆抗体能够检测真核细胞表达的hPD-L1蛋白,为进一步研究PD-1/PD-L1生物学活性奠定了实验基础.     

实验性家兔骨关节炎的基因治疗Ⅰ:带有治疗基因的穿梭载体pLXSNhIL-1ra的构建及真核表达

本研究用含有人白细胞介素 - 1受体拮抗蛋白基因 (hIL - 1ra)的质粒pCD1-hIL - 1a和反转录病毒穿梭质粒pLXSN ,通过基因重组的方法 ,重组完成带有治疗基因hIL - 1ra的反转录病毒穿梭质粒pLXSNhIL - 1ra。通过DNA限制性内切酶的酶切鉴定 ,证明插入方向正确 ,通过把pLXSNhIL - 1ra穿梭质粒转染到Cos - 7细胞中进行真核表达 ,证明该质粒能够成功表达hIL - 1ra基因产物 ,为下一步用hIL - 1ra对骨关节炎动物模型进行基因治疗工作奠定了基础。     

产碳青霉烯酶KPC-2的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的分离与耐药性研究

目的：研究临床分离的1株肺炎克雷伯菌（ KPN）和1株铜绿假单胞菌（ PAE）对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法利用种属特异基因PCR扩增、MALDI－TOF质谱技术及细菌16S rDNA测序鉴定细菌种属;采用VITEK 2 Compact系统检测细菌对各类抗生素的最低抑菌浓度（ MIC）;应用改良型Carba NP法、质粒抽提、电转化实验、耐药基因PCR扩增及测序,分析细菌编码的β－内酰胺酶基因。结果临床分离的1株KPN和1株PAE及其相应的转化子均产A类酶,PCR扩增测序显示PAE含有blaKPC－2型碳青霉烯酶编码基因,KPN含有blaKPC－2型碳青霉烯酶编码基因和blaSHV型超广谱β－内酰胺酶编码基因。二者的转化子只有blaKPC－2编码基因。结论临床分离的耐碳青霉烯类抗生素的KPN和PAE均携带A类2f组型碳青霉烯酶blaKPC－2编码基因且位于质粒上,而KPN所含的超广谱β－内酰胺酶blaSHV编码基因可能位于不同质粒上,或存在于该菌的染色体上。