两株抗肝癌人-鼠杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立两株产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤.方法用IL-2和美洲商陆(PWM)体外刺激肝癌病人外周血淋巴细胞再与小鼠骨髓NS-1融合,待杂交瘤生长进行筛选、克隆化及特性分析.结果建立了两株产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤AF3、CB7.二种单抗均识别肝癌细胞表面抗原,并具有显著的补体依赖的细胞毒活性.其中AF3的效价最高.结论通过人一鼠杂交瘤技术获得了产生人源性抗肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系.抗体效价高,是一种较理想的单克隆抗体.     

未活化巨噬细胞对杂交瘤/瘤细胞作用的研究

 用正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液（MφSN）培养杂交瘤细胞，瘤细胞，正常细胞，用台盼兰染色法。（³H）-TdR掺入法，ELISA法观察Mφ-SN中能够刺激杂交瘤/瘤细胞生长的活性物质，对该物质的生物活性进行探讨。结果表明：Mφ-SN中含有刺激杂交瘤/瘤细胞生长的活性物质，该物质不能使ConA激活的T细胞增殖，也不能刺激C₃H，/HeJ小鼠胸腺细胞增殖，其生物活性不同于白细胞介素-1（IL-1），IL6。     

人源性抗肝癌单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的建立产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤.方法用IL-2和美洲商陆(PWM)体外刺激肝癌病人外周血淋巴细胞,再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,待杂交瘤生长进行筛选、克隆化及特性分析.结果建立了3株产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤-AF3,CB7、CH1.三种单抗均识别肝癌细胞表面抗原,并具有显著的补体依赖的细胞毒活性.其中AF3的效价最高.结论通过人-鼠杂交瘤技术获得了产生人源性抗肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系.抗体效价高,是一种较理想的单克隆抗体.     

抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制

摘 要? 目的：研制抗肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞的靶向治疗提供候选抗体药物。方法：从人肝癌组织中分离人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stem-like cells, hLCSLCs）,免疫BALB/c裸鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单抗库。应用细胞免疫荧光、无血清成球培养、裸鼠皮下成瘤等方法筛选、鉴定特异识别肝癌干细胞的单克隆抗体。流式细胞仪分选hLCSLCs侧群细胞（hLCSLCs side population cells, hLCSLCs-SP）,无血清悬浮培养法和CCK-8法检测杂交瘤单抗对hLCSLC-SP自我更新和增殖能力的影响。结果：细胞融合后获得2 964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中,有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合,其中的33株杂交瘤单抗只与hLCSLC-SP反应（阳性率为2%~5%）、不与非hLCSLC-SP反应。该33株单抗中有6株能与CD133阳性细胞有不同比例的共染,并且与无血清悬浮培养的成球细胞呈阳性反应(阳性率为3%~26%),明显高于hLCSLCs-SP。裸鼠皮下接种1×104个15D2单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。功能性筛选实验发现,6株单抗中的4株能显著抑制hLCSLC-SP的增殖和成球生长,其抑制率分别为24%~42%和13%~50%。结论：采用自建的大容量单克隆抗体库技术,筛选获得了4株特异性识别hLCSLC-SP的功能性单抗,为肝癌干细胞的抗体靶向治疗奠定了基础。     

分泌抗人甲胎蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用免疫亲和层析法纯化的正常胎儿组织中的甲胎蛋白(AFP)为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0采取淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法进行四代克隆化后。获得十株稳定分泌抗人AFP单克隆抗体杂交瘤细胞株。其细胞培养上清中AFP单抗滴度为1:160～640,诱生同系小鼠腹水中单抗滴度为1:4000～100,000。特异性中和抑制试验显示单抗是针对AFP的。放射免疫分析示某些单抗具有较强的亲和力。杂交瘤细胞染色体数目为100～110,其分泌的抗体分别属于IgG_(2a)、IgG_1和IgM型。     

HER2抗独特型单克隆抗体的制备和初步研究

目的:研制HER2抗独特型单克隆抗体,为进一步深入研究乳腺癌抗独特型抗体疫苗奠定基础。方法:用人HER2蛋白免疫家兔,获得特异性兔抗HER2抗体。再用兔抗HER2抗体免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备HER2抗独特型单克隆抗体。并筛选出β型HER2抗独特型单克隆抗体。结果:ELISA检测结果表明,获得的兔抗HER2抗体能特异性地与HER2蛋白结合,其OD值随HER2的浓度呈正线性关系。用兔抗HER2抗体免疫小鼠获得一株稳定分泌HER2抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞1F5,其分泌的单克隆抗体能特异性的和兔抗HER2多克隆抗体结合,并与HER2产生竞争抑制作用。用1F5抗独特型单克隆抗体免疫家兔得到的抗血清能和HER2特异性的结合。该抗体亚型为IgG3,未浓缩腹水的效价为1∶1.02×104。结论:抗独特型单克隆抗体为β型HER2抗独特型抗体,有可能成为乳腺癌抗独特型单克隆抗体疫苗。     

靶向肿瘤血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性抗体的研制

背景与目的:肿瘤的生长依赖于新生血管形成,阻断其血管形成可有效治疗肿瘤.本研究旨在研制抗人肝癌血管内皮细胞的功能性单克隆抗体,确定其抑制人肝癌移植瘤生长的作用.方法:用从新鲜人肝癌组织中分离、鉴定、培养的人肝癌血管内皮细胞免疫10只BALB/c小鼠.免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后采用甲基纤维素选择培养.使用活细胞免疫荧光、细胞增殖、内皮成管实验及"人源化血管"动物模型体内抑瘤实验筛选和鉴定有治疗潜力的功能性抗体.结果:细胞融合产生1 442个单个集落的杂交瘤株,获得119株阳性克隆,其中53株是具有抑制人肝癌血管内皮细胞增殖、成管的功能性抗体,2株被证实能抑制人肝癌移植瘤在BALB/c裸鼠体内的生长,抑瘤率为66.7%～76.5%.结论:建立了高通量制备、筛选、鉴定内皮细胞功能性单抗技术,获得了2株具有靶向血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性单抗.     

抗原分子量50KD和42KD的人体小细胞肺癌单克隆抗体

利用人体小细胞肺癌细胞株为免疫原,从融合的杂交瘤中筛选出4B_3,2F_7和6H_(10)等一批小细胞肺癌单克隆抗体。杂交瘤染色体数为101～105,分泌抗体都是鼠IgG_(2a)型在体外用ELISA进行的结合反应中,4B_3和2F_7只与小细胞肺癌细胞株起反应,而与肺腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病、正常肺等无明显反应。在用细胞悬液滴的ABC染色法中,抗体与     

EGFRvⅢ单克隆抗体研制与鉴定

目的:制备针对EGFRvⅢ的单克隆抗体,以期待其对消化道肿瘤的靶向治疗.方法:通过人工合成EGFRvⅢ与KLH连接,免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠源性单克隆抗体细胞株,经腹水生产抗体,并对抗体进行纯化和相关性质鉴定.结果:合成EGFRvⅢ的基因缺失融合区的相应14肽,短肽与蛋白载体KLH连接作为抗原,免疫Balb/c小鼠.制备针对表达EGFRvⅢ肿瘤而对正常组织无破坏作用的的单克隆抗体.通过常规免疫程序获得高效价(1∶128 000)抗血清的免疫小鼠后,进行细胞融合,制备杂交瘤单克隆抗体细胞.应用ELISA检测的方法筛选鉴定能分泌EGFRvⅢ抗体的杂交瘤细胞株,经亚克隆获得5株鼠源性成系抗体阳性细胞株.阳性细胞株经扩大培养,注射于小鼠腹腔以大量制备抗体.抗体型别鉴定为IgG2a,并对抗体效价及其相对亲合力进行测定.腹水效价达1∶128 000,亲和力最高达9.8×10-9 mol/L.用表达的正常EGFR配体结合区蛋白检测自制抗体的特异性,结果显示抗体不与正常EGFR配体结合区蛋白结合.结论:成功制备了抗鼠EGFRvⅢ单克隆抗体,为后续抗肿瘤的靶向治疗奠定基础.     

抗CNE_2细胞单克隆抗体的制备

以CNE_2细胞为免疫原,利用单克隆抗体技术,获得3株杂交瘤细胞株。其相应分泌的A_3,B_5,A_5单克隆抗体均属小鼠IgG_1亚类。它们与CNE_2细胞呈阳性反应,与人ABO红细胞及混合淋巴细胞显示阴性反应;与9株不同来源的细胞系有交叉反应。其中A_3抗体的交叉较广(8/9)其次是A_5(6/9),B_5     

分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤SP_2/O细胞与用人甲胎蛋白抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合,经多次筛选,获得7株分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其培养液上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-6～9-)。杂交瘤腹水经硫酸铵盐析,DEAE纤维素层析,或免疫吸附亲和层析法纯化,每ml腹水单克隆抗体的产量为1～2mg。用ELISA,免疫双扩散、聚丙烯酰胺凝胶电泳、间接免疫荧光法鉴定了单克隆抗体的特异性、亲和力、稳定性及IgG亚类。     

人白介素24单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗白细胞介素24（Interleukin 24,IL-24）的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：应用分子生物学技术,构建含人IL-24编码序列的原核表达载体,表达并纯化了人IL-24融合蛋白。用纯化人IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,采用免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。结果：获得3株能稳定分泌抗IL-24单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G2,3F4,4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示,这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。结论：成功制备抗IL-24单克隆抗体,为进一步探索IL-24在抗肿瘤中的作用机制奠定了基础。     

胃癌单克隆抗体的制备及其免疫组化研究

以低分化胃癌细胞株MKN-46-9免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,获得分泌抗胃癌单克隆抗体的杂交瘤株MG-5,-7,-9及-11。该杂交瘤株可稳定地分泌高效价抗体,能直接用于常规福马林固定,石腊包埋的切片的染色。ABC免疫酶染色表明,对应抗原在各种人体组织的分布有一定的限定性。MG-7及MG-9两种单抗对     

抗上皮细胞黏附分子单克隆抗体的制备及应用

 目的　制备抗人类上皮细胞黏附分子（EpCAM）的单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定及初步功能研究。方法　将原核表达的EpCAM免疫BALB／c小鼠,按常规方法将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2／0细胞进行融合,用酶联免疫吸附试验进行阳性克隆的筛选。免疫印迹法对制备的mAb进行鉴定,用免疫组织化学法对临床的3份大肠癌组织样本进行初步检测。结果　酶联免疫吸附试验筛选获得了3株分泌抗EpCAM的mAb杂交瘤细胞株1B10、3G2和4E11。免疫印迹检测结果表明,3株杂交瘤细胞株分泌的抗体均能与EpCAM呈阳性反应,与GST蛋白不发生反应。免疫酶组织化学染色结果显示3株mAb能使3份大肠肿瘤组织样本呈现阳性反应,效果优于对照mAb。结论　成功地制备了3株识别大肠癌细胞表面抗原的mAb,这些mAb在大肠癌的诊断中可能具有一定潜在的应用价值。     

抗人微管不稳定蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备人微管不稳定蛋白（Stathmin）的单克隆抗体,检测Stathmin蛋白在真核细胞中的表达,为探讨Stathmin 生物学功能奠定基础。方法利用重组Stathmin蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗Stathmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了2株稳定分泌抗Stathmin的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。两株单克隆抗体通过免疫组织化学实验和Western blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的Stathmin蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗Stathmin蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Stathmin的生物学功能及其与肿瘤的关系创造了条件。     

内皮素在培养的肝癌细胞中的表达及其作用

 目的：确定人肝癌细胞合成释放内皮素（ET）与否；探讨外源性ET-1对培养的人肝癌细胞增殖的影响。方法：应用特异性放射免疫分析法测定肝癌细胞（HCC9204和SMMC7721）培养液中ET-1含量；采用3H-胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入和液体闪烁技术观察ET－1（10^－11～10^－7mol／L）对培养的加或不加表皮生长因子（EGF）的肝癌细胞增殖的影响。结果：培养的肝癌细胞HCC9204和SMMC7721均能分泌ET－1，并呈时间依赖性。培养24h为分泌高峰期，HCC9204和SMMC7721在有血清条件下ET-1浓度分别为86．38±7．7Pg／ml，76．32±8．4pg／ml，均显著高于各自无血清组（28．16±3．34pg／ml，23．22±4．72pg／ml）（P＜0．01）。ET－1单独作用对肝癌细胞DNA合成没有影响（P＜0．05）；在EGF（1nmol／L）存在时，ET－1在10^－11～10^－17mol／L时DNA合成增殖率为27．4％～86．6％（P＜0．05），且呈剂量依赖性（γ=0．7531，P＜0．05）。结论：人肝癌细胞可合成并分泌ET；ET－1单独作用对肝癌细胞DNA合成没有影响，但能明显增强EGF对肝癌细胞的增殖作用。     

基因免疫制备人PAK4单克隆抗体及其部分特性的鉴定

背景与目的:制备人PAK4单克隆抗体可以用于临床诊断恶性肿瘤,同时为深入探讨PAK4蛋白的功能提供可靠途径.材料与方法:用重组PAK4质粒(以P3XFLAG-CMV-10表达质粒为载体)免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠,通过细胞融合与克隆,筛选PAK4特异性单抗.结果:得到稳定分泌PAK4抗体的单克隆杂交瘤细胞2株,分别命名为2D1和3H4;间接ELISA方法测得2株PAK4单抗腹水效价为1∶1.0×104;单抗亚类鉴定表明2D1是IgG类,3H4是IgM类;免疫组化试验显示2株单抗均与临床两例乳腺癌组织管状上皮细胞高度反应.结论:PAK4单克隆抗体特异性较好,可用于临床肿瘤组织诊断.     

结肠癌单克隆抗体MC3、5、7、10的制备及其相应抗原免疫组化定位的研究

本文报导用结肠癌转移淋巴结分离之癌细胞免疫小鼠制得4株单克隆抗体即MC 3、5、7、10。杂交瘤细胞已经过150余天的连续培养,至今分泌抗体稳定,抗体效价高。能直接用于福尔马林固定石蜡包埋的切     

抗人肝癌细胞膜单克隆抗体HCMP—1的制备及其生物学特性的初步鉴定

用超选择免疫法，诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠对正常人肝细胞抗原产生选择性低兔疫反应后，二步腹腔注射人肝癌细胞悬液，２－４周后用人肝癌细胞作强化免疫动物１次，取出脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞用ＰＥＧ法融合制备杂交瘤。采用细胞抗原ＥＬＩＳＡ法，同时测定培养上清对肝癌细胞及正常肝细胞的免疫反应，筛出一株能稳定分泌抗人肝癌细胞膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，ＨＣＭＰ－１ＭＡｂ是一种ＩｇＧ２亚型的单抗，它与ＨＢｓ     

抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的初步研究

目的:研制抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性单抗,鉴定该单抗识别的抗原分子.方法:以人肝窦内皮细胞(human liver sinusoidal endothelial cell, HLSEC)免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用甲基纤维素选择培养液培养,制备抗HLSEC的单克隆抗体库.采用免疫荧光染色、黏附实验等方法筛选、鉴定能抑制结肠癌Ls174T细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性单克隆抗体.提取肝窦内皮细胞膜蛋白,采用Western blotting方法鉴定单抗识别的功能性抗原蛋白.结果:HLSEC免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合后产生1 440个杂交瘤株,获得119株产生抗HLSEC抗体的阳性克隆,其中20株能显著抑制具有肝转移能力的结肠癌Ls174T细胞与HLSEC的黏附;其中15株为IgM型,3株为IgG型,2株测不到重链;其中1株抗黏附能力最强的单抗(黏附抑制率为51%)命名为12B6,该单抗在5～200 μg/ml范围内显著阻断HLSEC与Ls174T的黏附,且呈剂量依赖性;单抗12B6所识别的HLSEC抗原蛋白的相对分子质量为46 000.结论:建立了抗HLSEC单克隆抗体库,获得了20株具有抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性抗体,初步鉴定了一种可能参与结肠癌肝转移的黏附分子,为结肠癌的组织器官特异转移机制及靶向治疗的研究奠定了一定的基础.