趋化因子受体CXCR4小干扰RNA对人大肠癌细胞株迁移的抑制作用

目的:探讨趋化因子受体CXCR4小干扰RNA(siRNA)对人大肠癌细胞株迁移的抑制作用.方法:采用RT-PCR、Western印迹和体外迁移实验检测趋化因子受体CXCR4在大肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo 细胞的表达及迁移能力.将与CXCR4 mRNA互补的 siRNA及非抑制性双链RNA(Non-silencing dsRNA),在脂质体介导下以150 nmol/L终浓度转染大肠癌细胞SW480,以RT-PCR和Western印迹法检测CXCR4表达的变化,Transwell迁移实验检测大肠癌细胞SW480迁移的变化.结果:大肠癌细胞SW480高表达CXCR4,大肠癌细胞LoVo低表达CXCR4,SW620的CXCR4表达水平介于二者之间.与LoVo 细胞相比,SW480和SW620迁移细胞明显增多(P＜0.01).与对照组、脂质体组和Non-silencing dsRNA组相比,siRNA组SW480细胞内CXCR4 mRNA和蛋白均明显降低,细胞迁移被明显抑制 (P＜0.01).结论:CXCR4 siRNA可通过下调CXCR4的表达抑制人大肠癌细胞SW480的迁移.     

热休克蛋白27在大肠癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 探讨热休克蛋白27(HSP27)表达与大肠癌淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组化方法检测68例临床大肠癌组织标本中Hsp27的表达情况.应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测不同转移潜能大肠癌细胞株中Hsp27 mRNA和蛋白的表达情况.结果 在大肠癌组织中,热休克蛋白27的表达率与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期无相关性(χ2test,P＞0.05),但其过表达和大肠癌淋巴结转移显著负相关(Fisher's exact test,P=0.035).应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测结果显示Hsp27基因和蛋白在高淋巴结转移潜能的SW620细胞中呈低表达,在低淋巴结转移潜能的SW480细胞中呈高表达.结论 Hsp27和大肠癌肿瘤细胞的转移行为可能为负相关,可能在阻止其转移中发挥重要作用.     

dUTP焦磷酸酶在大肠癌细胞和组织中的差异表达

目的 验证dUTP焦磷酸酶（dUTPase）在人4种大肠癌细胞SW480,SW620,LoVo,SW1116和组织的差异表达.方法 RT-PCR检测人4种大肠癌细胞SW480,SW620,LoVo,SW1116中焦磷酸酶的mRNA表达水平,并通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸（PPi）来测定这4种大肠癌细胞dUTPase的酶活性.免疫细胞和组织化学检测焦磷酸酶的蛋白表达差异.结果 dUTPase在SW620和LoVo细胞的mRNA水平和酶活性高于SW480和SW1116细胞.大肠癌SW620,LoVo细胞免疫化学dUTPase表达高于SW1116、SW480细胞.大肠增生性息肉和腺瘤性息肉dUTPase的表达低于大肠癌.结论 焦磷酸酶dUTPase在人4种大肠癌细胞和组织存在差异表达.     

RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因对大肠癌细胞凋亡的影响

目的应用RNAi技术将c-FLIP(L)对应的SiRNA片段对大肠癌细胞株SW480凋亡的影响,明确RNAi靶向沉默c-FLIP基因在TRAIL介导的凋亡途径中的作用。方法与c-FLIP(L)对应的SiRNA片段转染入细胞,半定量RT-PCR法判断干扰前后FLIPmRNA水平的变化,Westernblot分析FLIP蛋白水平变化,比较分析干扰前后细胞对介导的凋亡敏感性的改变及转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况。结果 c-FLIP(L)可以减低SW480中FLIPmRNA和蛋白水平(P0.01),转染FLIP-siRNA后,TRAIL对大肠癌胞株SW480的遏制作用显著加强(P0.05),TRAIL介导凋亡明显增高(P0.05)。结论 RNAi靶向沉默c-FLIP(L)并能提高SW480对TRAIL灵敏度并诱使SW480凋亡。     

P38信号转导通路在胃泌素促进人大肠癌细胞SW480增殖中的作用及其机制

目的:探讨胃泌素对人大肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响,以及P38-丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的关系。方法:体外培养大肠癌SW480细胞株,将细胞分为对照组、胃泌素组、丙谷胺组和胃泌素+丙谷胺组,对照组不加药,其余组加不同浓度的药物处理。运用MTT法观察细胞凋亡情况,确立5-肽胃泌素和丙谷胺处理SW480细胞的最佳浓度;流式细胞术检测各组细胞增殖指数的变化;qRT-PCR检测大肠癌SW480细胞株胃泌素受体/胆囊收缩素-B受体(CCK-2R)mRNA表达情况;Western blot检测P38蛋白表达及其磷酸化水平。采用方差分析和SNK-q检验进行统计学分析。结果:SW480细胞中存在CCK-2R mRNA表达。胃泌素在6.25²00.00 mg/L范围内能抑制大肠癌SW480细胞的凋亡,且当浓度达12.50 mg/L时为最佳浓度(P<0.05);单独丙谷胺对大肠癌SW480细胞凋亡无明显影响(P>0.05),但丙谷胺在8.00200.00 mg/L范围内能抑制大肠癌SW480细胞的凋亡,且当浓度达12.50 mg/L时为最佳浓度(P<0.05);单独丙谷胺对大肠癌SW480细胞凋亡无明显影响(P>0.05),但丙谷胺在8.00²56.00 mg/L范围内能明显拮抗胃泌素抑制SW480细胞的凋亡作用,其最佳浓度为16.00 mg/L(P<0.05)。胃泌素(12.50mg/L)组细胞增殖指数为(34.56±1.41)%,显著高于对照组的(28.74±1.61)%和胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)组的(28.72±1.78)%(P<0.05),而丙谷胺(16.00 mg/L)组细胞增殖指数为(27.75±2.29)%,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);P38蛋白及其磷酸化在胃泌素组(12.50 mg/L)中表达水平低于对照组(P<0.01),也低于胃泌素(12.50mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)组(P<0.01)。结论:胃泌素可以抑制大肠癌细胞株SW480的凋亡、促进增殖,其作用可能是通过抑制P38及其磷酸化水平来实现的,但能够被其受体拮抗剂丙谷胺抑制。     

运用FQ RT-PCR和Western blot检测Claudin-1在人类大肠癌细胞株的表达

目的:探讨密连接蛋白Claudin-1与人类大肠癌进展的关系.方法:采用实时荧光定量RT-PCR(FQ RT-PCR)和Western blot,检测Claudin-1在3株不同分期人类大肠癌细胞株中的表达.结果:Claudin-1在大肠癌Dukes'type C期细胞株SW620强表达,Dukes'type B期细胞株SW480次之,Dukes'type A 期细胞株SW1116最弱.结论:Claudin-1在人类大肠癌细胞株中有表达,其表达量与大肠癌分期有关.     

siRNA沉默PAR1基因表达对大肠癌细胞侵袭力的影响

目的:研究RNA干扰活性蛋白酶受体(Pmtease-activated receptors,PARl)表达以及对人类大肠癌细胞侵袭力的影响.方法:体外化学合成PAR1基因序列特异性双链RNA(dsRNA),在脂质体(Lipid)的介导下转染入人大肠癌Lovo细胞株,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用RT-PCR和Western blot检测PAR1mRNA和蛋白表达,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:干扰片段转染组的转染Pgenesil-1-PAR1-siRNA后大肠癌Lovo细胞株的PAR1基因和蛋白的表达被PAR1-siRNA有效沉默,与阴性对照组、空白质粒转染组相比PAR1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05).转染48h后测定大肠癌Lovo细胞的侵袭力明显降低(P<0.01).结论:PAR1-siRNA能有效抑制人大肠癌细胞株PAR1基因和蛋白的表达,降低人大肠癌细胞的侵袭力.     

大肠癌细胞表达的Fas配体具有功能性

目的：探讨大肠癌细胞Fas配体（FasL）mRNA和蛋白的表达及其功能。方法：分别采用RT-PCR和Western印迹法以及氚释放细胞活性测定技术检测大肠癌细胞株中FasL mRNA和蛋白的表达及其功能。结果：所检测的6株大肠癌细胞（RPMI4788、HCT-116、DLD-1、LoVo、WiDr和COLO 320DM）全部表达FasL mRNA和蛋白;DLD-1,LoVo和WiDr等部分大肠癌细胞具有Fas依赖的细胞毒活性。其中DLD-1细胞活性具有量效关系,并且乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA）和离子霉素（ionomycine）刺激能显增强DLD-1的细胞活性。结论：DLD-1、LoVo和WiDr等3株大肠癌细胞表达功能性Fas配体,并可能以此反击机体免疫系统,逃避免疫监督。     

肿瘤坏死因子和干扰素对大肠癌Fas配体表达的调控作用

目的 :探讨不同细胞因子对大肠癌细胞 Fas配体 (Fas L )表达水平的调控作用。方法 :采用 Western印迹法测定了两种细胞因子 (1× 10 6 U / L TNF-α或 IFN-γ)处理后大肠癌细胞 Fas L表达水平的变化。结果 :所检测的 6株大肠癌细胞全部表达 Fas L蛋白 ;TNF-α和 IFN-γ处理 DL D- 1细胞 10 h,显著上调其 Fas L蛋白的表达水平 ;TNF-α和 IFN-γ以及 PMA +离子霉素 (ionomycin)处理 SW6 2 0细胞 10 h,也显著上调 SW6 2 0细胞的 Fas L蛋白表达水平。 TNF-α和 PMA +离子霉素处理SW6 2 0细胞 48h进一步增加 SW6 2 0的 Fas L 蛋白表达 ,IFN- γ处理 SM6 2 0则表达增加不明显。结论 :TNF- α和 IFN- γ等细胞因子具有上调某些大肠癌细胞 Fas L 表达的作用     

黑素瘤抗原-1基因在非小细胞肺癌中的表达

目的:检测黑素瘤抗原-1(MAGE-1) mRNA及其编码的肿瘤抗原在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨以该抗原作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性.方法:用RT-PCR方法和流式细胞术(FCM)对3种人肺癌细胞系、56例NSCLC标本和相邻正常肺组织标本MAGE-1 mRNA及蛋白的表达情况进行检测.结果:MAGE-1 mRNA及蛋白在3种人肺癌细胞系均表达;56例NSCLC标本中,27例表达MAGE-1 mRNA,22例表达MAGE-1蛋白,而在相邻正常肺组织中均不表达.结论:MAGE-1 mRNA及蛋白在NSCLC中具有较高的表达频率,提示该抗原有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点.     

Increased sensitivity of colorectal cancer cell lines with microsatellite instability to 5-fluorouracil in vitro

Objective To study the relationship between sensitivity to 5-FU and the status of a panel of microsatellite loci in three human colon cancer cell lines.Methods Cell viability in several concentrations of 5-FU was assessed by the MTT test. Expression of hMSH2 and hMLH1 in LoVo, SW480 and SW1116 cells were analyzed by immunocytochemical staining. Ten mononucleotide and dinucleotide microsatellite loci were analyzed by the PCR-SSLP-silver staining method. Results By MTT assay, it showed that LoVo cells were more sensitive than SW480 and SW1116 cells (0.8 μmol/L, 2.2 μmol/L and 1.9 μmol/L, respectively,P&lt;0.05). By immunocytochemical staining, hMSH2 was expressed in SW480 and SW1116 cells but not in LoVo cells, while hMLH1 was positive in all three cell lines. The PCR-SSLP-silver staining of 10 microsatellite loci revealed that LoVo cells had a different pattern of electrophoretic bands compared with SW480 and SW1116 cells, manifesting both additions and band-shifts. Conclusion Together with hMSH2 and hMLH1, the status of a panel of microsatellite loci may be used as convenient predictors for drug-optimization or prognosis-assessment in colorectal cancer patients before chemotherapy.     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的：建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株，观察Fas基因在转导前后的表达，方法：采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间，以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo ,用G418筛选克隆细胞，以dot blotting,Westting blotting检测转导细胞Fas基因的表达，结果：成功建立了Fas基因表达株，转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株，转导细胞增殖速度，倍增时间，对数生长期等均比非转导株更为缓慢，但无显著性差异，在Fas抗体作用下，转导株细胞生长明显受到抑制，有非常显著性差异，结论：Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态，通过真核表达载体介导，Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达，Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异，筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA，逆转录成cDNA探针，经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交．用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异，其中有104个基因的表达值有意义，包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的，高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异,筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA,逆转录成cDNA探针,经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交,用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异,其中有104个基因的表达值有意义,包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的,高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。     

Sonic hedgehog在大肠癌细胞株中表达缺失与其启动子高甲基化有关

目的:研究sonic hedgehog(SHH)在大肠癌细胞株的表达及其调控机制。方法:RT-PCR检测SHH mRNA在大肠癌细胞株HCT-8、SW1116、SW480及LOVO中的表达,去甲基化试验观察5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)处理细胞株后对SHH mRNA表达的影响,采用亚硫酸盐修饰后测序法检测SHH启动子区甲基化状况。结果:SHH mRNA在HCT-8中仅有弱表达,在SW1116、SW480及LOVO中表达缺失,去甲基化处理后,其表达与对照组相比显著增强(P<0.001);SHH启动子在大肠癌细胞株中为高甲基化状态。结论:SHH在大肠癌细胞株中表达缺失与其启动子高甲基化有关。     

Hsa-miR-186在结肠癌细胞中的表达及作用

目的检测hsa-miR-186在结肠癌组织及细胞中的表达,探讨hsa-mir-186对结肠癌细胞生物学特性的影响及作用。方法
应用实时荧光定量PCR 检测了miR-186 在12 对配对的结肠癌组织、癌旁组织和5 株结肠癌细胞中的表达情况;扩增包含
miR-186前体序列在内的基因片段,并将其克隆至PLVTHM载体,将PLVTHM- miR186质粒转染SW620细胞,流式分选慢病
毒感染的SW620细胞;CCK-8法、划痕实验和Transwell检测细胞检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western Blot检测靶基因
YY1 蛋白水平的表达。结果与癌组织相比,12 例癌组织中miR-186 的平均表达量为0.0024±0.0027,显著低于癌旁组织的
0.066±0.068,P=0.008;miR-186 在高转移潜能的人结肠癌细胞SW620 和LOVO相对表达量分别为0.118±0.138 和0.157±
0.001,与在低转移潜能HT-29 细胞中表达量1.000 ± 0.00,差异具有统计学意义P<0.05;质粒双酶切及测序鉴定
PLVTHM-hsa-miR186重组质粒构建成功;荧光定量PCR表明稳定过表达miR-186的结肠癌细胞株SW620构建成功,且过表达
miR-186后降低了细胞的增殖、迁移及侵袭能力,差异均具有统计学意义P<0.05。稳定过表达miR-186的细胞中,miR-186的表
达明显高于对照组和未处理组,YY1蛋白质水平有所下降。结论hsa-miR-186在结肠癌组织以及在高转移潜能的人结肠癌细
胞SW620、LOVO中低表达,具有类似抑癌基因的作用;成功构建PLVTHM-miR186慢病毒重组质粒,并稳定转染结肠癌细胞
SW620,抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力。miR-186调控YY1表达可能是抑制结直肠癌生物特性的重要机制之一。
     

环氧化酶2基因异常表达与大肠癌转移的关系

目的 研究环氧化酶2在人大肠癌细胞系及大肠癌组织中的异常表达与意义。方法 培养不同转移能力的人大肠癌细胞系SW480和SW620细胞，收集50例大肠癌石蜡组织，50例淋巴结转移性大肠癌石蜡组织：分别用免疫组织化学、Real-time PCR的方法研究环氧化酶2在不同转移能力人大肠癌细胞系及原发人大肠癌组织和大肠淋巴结转移组织中的表达。结果 环氧化酶2蛋白在SW480和SW620细胞株中均阳性表达；环氧化酶2mRNA在SW620比SW480细胞中表达增高，表达量的平均倍比关系为2．268。环氧化酶2蛋白在淋巴结转移癌组的异常表达高于原发大肠癌石蜡组织，相关性具有统计学意义（P〈0．05）。结论 环氧化酶2异常表达可能与大肠癌淋巴结转移相关。     

NK细胞联合西妥昔单抗对大肠癌细胞ADCC作用的研究

目的比较3株肠癌细胞株(LOVO、SW480、SW620)与自然杀伤(natural killer,NK)细胞、西妥昔单抗(Cetuximab)混合作用之后,NK细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell cytotoxicity,ADCC),探讨Cetuximab抗肿瘤过程中ADCC的作用。方法免疫组织化学方法检测3种不同肠癌细胞系(LOVO、SW480、SW620)的EGFR表达水平;MTT法检测6种不同浓度Cetuximab作用48h后肿瘤细胞的生长抑制情况;NK细胞与Cetuximab包被的肿瘤细胞共孵育,LDH法检测NK细胞的ADCC功能变化。结果免疫组织化学结果显示,3株细胞EGFR表达:LOVO(),SW480(+),SW620(-);Cetuximab对LOVO细胞和SW480细胞的生长抑制呈剂量依赖,对SW620细胞无抑制作用;LOVO细胞和SW480细胞经Cetuximab处理后,NK细胞的ADCC作用均增强且有统计学意义(P<0.05)。结论单独的Cetuximab可抑制EGFR阳性的LOVO细胞和SW480细胞,而对EGFR阴性的SW620细胞生长抑制作用不明显,所选的2株EGFR阳性肿瘤细胞都可被Cetuximab所介导ADCC作用所抑制,高EGFR表达的肿瘤细胞更加敏感。     

MicroRNA-93及Tspan1在结肠癌中的表达及其临床病理意义*

目的 探讨microRNA-93（miR-93）及Tspan1在结肠癌组织及细胞中的表达及其临床病理意义,预测两者的靶向调控关系。方法 选取手术切除结肠癌组织及对应癌旁组织74例,人结肠癌细胞株（SW480、SW620、HCT116、CaCo-2、LoVo、HT29）及正常人结肠上皮细胞株（FHC）,分别采用qRT-PCR及Western blotting检测miR-93、Tspan1 mRNA及Tspan1蛋白表达,观察两者在不同临床病理特征患者的表达差异,Pearson法分析miR-93与Tspan1 mRNA的相关性,采用TargetScan及GeneCard软件预测两者的靶向调控关系。结果 与癌旁组织比较,miR-93在结肠癌组织中表达降低（P?<0.05）,Tspan1 mRNA及蛋白在结肠癌组织中表达升高（P?<0.05）;与正常人结肠上皮细胞比较,miR-93在结肠癌细胞株中表达降低（P?<0.05）,Tspan1 mRNA及蛋白在结肠癌细胞株中表达升高（P?<0.05）;miR-93在远处转移、淋巴结转移阳性、血管浸润阳性及高TNM分期患者中低表达（P?<0.05）,Tspan1 mRNA在远处转移、淋巴结转移阳性、血管浸润阳性及高TNM分期患者中高表达（P?<0.05）。Pearson法相关性分析显示,miR-93与Tspan1 mRNA表达呈负相关[r?=-0.735（95% CI：-0.855,-0.535）,P?=0.000]。生物信息学预测,miR-93及Tspan1在3''-UTR区可能具有靶向调控关系。结论 miR-93在结肠癌中低表达,Tspan1在结肠癌中高表达,miR-93及Tspan1具有靶向调控关系,两者可能成为结肠癌的肿瘤标志物或预测因子。