弓形虫棒状体蛋白7真核表达载体的构建及其免疫保护作用

目的 构建弓形虫棒状体蛋白7(ROP7)基因的真核重组表达载体,观察其对小鼠的免疫保护作用.方法 根据GenBank发表的弓形虫ROP7序列设计合成一对引物,通过PCR扩增ROP7基因,将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1/ROP7(pROP7).用重组质粒转染HEK293T细胞并验证其在细胞内的表达.将36只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组、pEGFP-C1对照组和pROP7实验组.然后用PBS、pEGFP-C1和pROP7分别免疫相应组别的小鼠.采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,观察弓形虫感染小鼠后的存活时间并评价其免疫保护力.结果 PCR扩增出1 728 bp的目的基因片段,真核表达载体构建成功,且能在HEK293T细胞中表达.目的基因的相应蛋白可被羊抗弓形虫多克隆抗体识别.重组质粒免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体.虫体攻击试验中,pROP7实验组小鼠的生存时间较对照组小鼠延长(P< 0.05).结论 本研究构建的真核表达质粒在对抗弓形虫感染时具有一定的免疫保护作用,为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考.     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

SAG1和ROP1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法将SAG1和ROP1编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NIH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群;腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用.结论不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

弓形虫棒状体蛋白的免疫原性及其DNA疫苗的研制

目的研制抗弓形虫DNA疫苗,评价其免疫原性及免疫保护作用,进而推广应用。方法首先用RH株弓形虫速殖子提取基因组DNA,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增棒状体蛋白2（ROP2）基因片段,将其克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫棒状体蛋白2DNA疫苗。再应用该疫苗免疫小鼠,取其血清、脾和淋巴结培养液检测免疫学指标评价其免疫原性,最后应用弓形虫攻击感染实验评价其免疫保护作用。结果PCR扩增出1.7kb ROP2基因片段,克隆、构建出pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗能诱发小鼠产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高且能正确识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠CD4^＋T细胞增殖明显,体液中各细胞因子含量均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,疫苗免疫保护率为88.9％,小鼠存活时间明显延长。结论pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗具有较强的免疫原性,安全可靠,能产生良好的免疫保护作用。     

SAGl和R0P1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的 检测混合SAGl和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法 将SAGl和ROP1编码基因片段克隆入pEGEP—N3表达载体，构建重组质粒；RT—PCR体外验证重组质粒在N1H3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫；流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群；腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠。结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAGl和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。结论 不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一。     

哈萨克族食管癌中survivin基因启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体

目的构建survivin基因启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体,研究survivin基因启动子区的甲基化状态对该基因表达及功能的影响。方法采用PCR方法从新疆哈萨克族食管癌的cDNA表达阳性的标本中扩增出survivin基因,以阳性组织基因组DNA扩增出survivin基因启动子区CpG岛,survivin基因经双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1相连,并转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌E.coliER1793中扩增。经测序正确后,将重组质粒及survivin基因启动子区CpG岛用HindⅢ酶切,连接后再次转入E.coliER1793中扩增。将重组质粒转染至食管癌细胞株Eca-109中,荧光显微镜观察结果。结果 DNA测序证明获得了包含ORF全长的survivin基因及其启动子区CpG岛,并将双序列成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中。转染后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白。结论成功构建真核表达载体,为进一步探讨survivin基因启动子区CpG岛甲基化状态对该基因在哈萨克族食管癌细胞株中的表达及功能的影响奠定了基础。     

pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达

目的:构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导人人肝癌细胞MHCCW中表达.方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,酶切和测序证明pEGFP-N1-lis真核表达载体构建成功.pEGFP-N1-lis转染MHCC97细胞后,Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

重组人IL-2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群及垂直传播的影响

目的研究重组人IL-2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群及垂直传播的影响。方法取BALB/C孕鼠90只,随机分为空白组、感染组、IL-2组。于妊娠第8d空白对照组腹腔注射0.2ml生理盐水,其余各组腹腔注射200个弓形虫速殖子,并于妊娠第7、8、9dIL-2组每只孕鼠腹腔注射1 000UIL-2,其余两组腹腔注射0.2ml生理盐水。妊娠第10、12、14、16d取妊娠鼠脾,流式细胞仪检测CD4~＋及CD8~＋水平,并在妊娠第12d解剖孕鼠,观察活胎率及胎仔脑组织弓形虫感染情况。结果与空白组相比,妊娠各期感染组的脾CD4~＋T细胞水平显著降低,而CD8~＋T细胞水平显著升高（第10、12、1 4d）,二者比值明显倒置;IL-2组的CD4~＋T细胞水平在妊娠第10、12、14d高于感染组,CD8~＋T细胞水平在妊娠第10、12、14d低于感染组,CD4~＋/CD8~＋T细胞比值在妊娠第10、12、14d高于感染组。活胎率也明显升高,宫内胚胎弓形虫感染率明显降低。结论 IL-2可以改善感染弓形虫孕鼠的细胞免疫功能,提高孕鼠免疫力,减少垂直传播概率。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

Immunity induced by DNA vaccine of plasmid encoding the rhoptry protein 1 gene combined with the genetic adjuvant of pcIFN-γ against Toxoplasma gondii in mice

Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid, pcIFN-γ, as a gene tic adjuvant and observe the immune responses elicited by pcDNA3-rhoptry protei n 1 （pc-ROP1） combined with pcIFN-γ against Toxoplasma gondii (T.go ndii) infection in mice.Methods A fragment of the IFN-γ gene was directly inserted into the pcDNA3 plasmid and identified by two restriction endonucleases digestion.pcIFN and pcROP1 DNA wa s injected into the left leg muscle of mice at a dosage of 100 μg, and a boost er vaccination was given at the same dosage after two weeks.Control groups wer e injected with pcDNA3 blank plasmid or normal saline.At 30, 50 and 70 days af ter booster injection, kinetic tests were carried out: MTT assay for the prolife ration response of T lymphocyte cells and the activity of NK cells, sandwich ABC -ELISA for the determination of IFN-γ, IL-2 and IL-10; a serum enzymetic aa ssay for nitric oxide (NO) in sera and ELISA for the titer of IgG antibody in sera.Results The recombinant plasmid, pcIFN-γ was constructed.The proliferation response of spleen T lymph cells, NK cell killing activity, and serum levels of IFN- γ, IL-2 and NO in mice injected with pcROP1 and pcIFN-γ were higher than in those injected with pcROP1 alone.There was no difference in IgG antibody level s between the two groups. Conclusion The genetic adjuvant, pcIFN-γ, could enhance the cellular immune response indu ced by DNA vaccine of pcROP1 in mice against Toxoplasma gondii infection.     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

Pim-3质粒构建体在大鼠活体肝组织的表达和活性的研究

目的 构建大鼠Pim-3绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒并观察其在活体肝组织的表达和活性。方法采用逆转录-PCR的方法获取目的cDNA,重组质粒经酶切鉴定和测序;大鼠活体基因肝靶向性转染通过尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导采用腹腔内注射内毒素和D-半乳糖胺（D-GaIN）来实现。动物分为A、B、C和D组（即正常、对照、空质粒和重组质粒组,每组8只）;肝组织GFP表达通过荧光显微镜、Pim-3表达通过逆转录（RT）-PCR方法检测;肝细胞凋亡采用缺口末端标记技术（TUNEL）分析和半胱天冬酶-3活性检测。结果成功构建GFP表达质粒pEGFP-N2／Pim-3;重组质粒和空质粒DNA通过流体力学注射法被成功转染人大鼠活体肝组织内;4组Pim-3的相对表达水平分别为0．06±0．02、0、0、0．49±0．15。D组与其他3组差异均有统计学意义（均P〈0．01）;4组肝细胞的凋亡指数（AI）分别为：（3．1±0．7）％,（72．5±6．1）％、（69．8±5．7）％和（4．9±1．2）％;肝组织半胱天冬酶-3活性分别为（60±15）、（147±55）、（142±50）和（76±27）pmol·min ·mg^-1,D组与B、C两组间差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论 构建的重组体质粒pEGFP-N2／Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。     

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型（GHRHR-SVT1）基因绿色荧光蛋白真核表达载体1（pEG—FP—N1）并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1／GHRHR—SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组：非转染组（对照组）,只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组（pEGFP-N1组）,加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组（pEGFP-N1／GHRHR-SVT1组）,加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果（1）pGEFP—N1／GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和BarnHⅠ双酶切产生约1080bp和4700bp2条带。（2）构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR—SVT1原始序列（AF-282259）进行对比,第54位碱基突变（A突变为T）,为无义突变。（3）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组（P〈0．01）。（4）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组（P〈0．01）。结论在适当浓度GHRH（10μmol／L）的培养基中,GHRHR—SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。