环介导恒温扩增技术快速检测大肠杆菌O157特异基因的建立

目的 建立环介导的恒温扩增快速检测大肠杆菌O157的方法。方法 采用环介导的恒温扩增反应（LAMP）技术扩增大肠杆菌O157特异性基因,并与传统PCR比较。结果与传统的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速、且在等温条件下进行,具有更高的灵敏性;特异性100%。结论 该方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备、为临床检测大肠杆菌O157提供了一个快速简便的新方法。     

SARS-Cov-2实验室检测技术的应用及展望

新型冠状病毒肺炎疫情爆发以来,我国的病毒检测能力不断提高,检测技术也在不断地发展和创新。以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和宏基因组测序为代表的病毒检测技术在辅助疾病确诊、监测病毒变异等方面发挥了关键作用;基于血清/血浆IgM/IgG抗体的检测技术是辅助确诊的重要方法;高特异性的逆转录环介导等温扩增技术、能够核酸定量的数字PCR和灵敏度更高的SHERLOCK技术也极具特色与发展潜力。以上检测技术代表了病原微生物检测技术的现在及未来发展方向。本文对新型冠状病毒检测技术的基本原理、技术特点及应用现状进行探讨。     

新型冠状病毒核酸荧光型RT-RAA检测方法的建立及其评价

目的 建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)荧光型RT-RAA快速检测方法.方法 以体外转录SARS-CoV-2的RNA为模板,利用单链DNA结合蛋白、重组酶和DNA聚合酶,在40.5℃恒温下,快速完成orf1ab基因和S基因序列片段的扩增,并用已知新冠核酸阳性和其他呼吸道病毒感染患者咽拭子标本进行初步评价.结果 该研究建立的方法分别检测SARS-CoV-2两种基因的所需时长均在20 min以内,检测2种基因的灵敏度均为2拷贝数/反应管,特异性为100％,2种引物的最低检出限3次重复实验扩增反应起峰时间一致,曲线形态接近.结论 该研究建立的方法灵敏性高,特异性强,重复性良好,临床标本检测结果符合率高,且不需要昂贵的仪器,适用于现场快速检测.     

中医药影响新型冠状病毒肺炎密接者转阳率的研究:一项大样本队列研究

  目的  观察中医药对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)密切接触者的核酸检测转阳率的影响,为中医药预防新型冠状病毒肺炎的应用提供依据。  方法  将扬州隔离点中使用和未使用中药(清肺排毒汤、扶正益清方)的COVID-19密接者纳入本研究,通过倾向性评分匹配和logistic回归分析对核酸扩增试验(NAATs)的阳性率、核酸阳性者的病毒载量、阳性者的病情等级进行分析,以评估中医药预防新型冠状病毒肺炎的作用。  结果  共收集了30 000余例观察对象,基于数据筛选、核对,以1 286例密接者作为研究对象,包括中医组1 016例(79.00%)和对照组270例(21.00%),共有转阳患者55例。在倾向性评分匹配分析前后,结果均显示在男性和大于60岁的老年人群中,中药组的转阳率低于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。多因素logistic回归(不纳入N值和O值)结果显示中药组转阳的风险与对照组相比降低了0.547倍。另外,密接者转阳后,中药组的总体和女性的病毒CT值高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。  结论  中医药有利于降低COVID-19密接者的转阳率和病毒载量。      

环介导等温扩增过程监测与结果分析技术研究进展

2000年,Notomi等[1]建立了一种新颖的核酸扩增方法—环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)。该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在恒温条件进行反应,不需要模板的热变性和长时间温度循环。较之于传统的PCR方法,其不但简便、快速、不需要昂贵     

新型冠状病毒检测技术的研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有高传染性和高隐蔽性,并且不断发生变异,产生不同类型病毒变异株,其主要传播途径是呼吸道飞沫传播、接触传播、气溶胶传播。快速准确的病毒检测技术对疫情防控工作具有重要意义。本文就SARS-CoV-2的病原学结构特点和当前实验室主要检测技术(病毒分离鉴定、高通量测序、荧光定量PCR、反转录环介导恒温扩增、基因芯片、抗原抗体检测和基于CRISPR/Cas系统的核酸检测)作一综述。     

LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的 研究利用环介导等温扩增（loop–mediated isothermal amplification,LAMP）结合核酸试纸条技术建立艰难梭菌（Clostridium difficile,CD）的快速检测方法,为艰难梭菌检测提供一种快速检测的方法。方法 收集2016年1月至2017年12月杭州市临安区第一人民医院临床感染性腹泻患者的粪便标本201份。根据艰难梭菌毒素A基因特异序列设计引物,选择6条最佳引物,用LAMP环介导等温扩增曲线、钙黄绿素目视法和核酸试纸条测试实验结果,再优选反应体系,最后检测粪便中的艰难梭菌。结果 LAMP法能在60℃条件下扩增1h检出艰难梭菌,对1株艰难梭菌和7株非艰难梭菌检测,只有艰难梭菌能检出阳性扩增,设计的引物具有良好的特异性。脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid,DNA）检出限为0.8pg/μl。结论 LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便艰难梭菌具有敏感度高、操作简便、特异性强、可视化、方便快捷的特点,适用于艰难梭菌的快速检测。     

新型EB病毒全自动核酸定量检测系统在儿童传染性单核细胞增多症快速诊断中的价值

  目的  对新型EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)全自动核酸定量检测系统进行性能验证,并探讨该系统在儿童传染性单核细胞增多症(IM)快速诊断中的价值。  方法  EBV全自动核酸定量检测系统包括核酸提取和实时荧光PCR(FQ-PCR)定量检测,分别采用PANA9600S全自动旋转式核酸工作站进行全血标本的核酸提取,ABI7500荧光PCR仪进行FQ-PCR扩增。然后验证EBV全自动核酸检测系统的性能指标,包括准确性、精密度、线性范围、检测限、防污染能力、交叉反应和抗干扰能力等。最后将EBV全自动核酸检测系统用于50例2018年11月—2019年6月温州医科大学附属第二医院的门诊及住院疑似IM患儿的核酸定量检测,并将EBV核酸检测结果与其他指标进行比较。  结果  EBV全自动核酸定量检测系统的准确性好,高、中、低水平的定量标准品均在定值范围内。检测精密度高,批内及批间精密度的CV值均＜5%。该检测系统在1.0×103~1.00×108 copies/mL线性范围内,线性相关系数≥0.980,检测限为5.0×102 copies/mL。另外,该检测系统的防污染能力良好,无交叉反应,抗干扰能力强。对50例儿童疑似EBV感染者的外周血进行核酸检测,阳性检出率为80.0%,EBV定量值在5.45×102~1.46×108 copies/mL,明显高于血清EBV IgM抗体检测(P=0.031)和血常规异型淋巴细胞检测(P < 0.001)。  结论  EBV全自动核酸定量检测系统的各项性能指标良好,可满足临床检测要求,可较好地用于疑似儿童IM的快速诊断,值得临床应用推广。      

胃癌相关基因Serpine1的RT-LAMP快速检测法

目的建立逆转录-环介导的等温扩增快速检测高侵袭型胃癌转移相关基因。方法快速抽提肝转移胃癌患者标本的RNA用环介导的等温扩增反应(LAMP)扩增转移相关基因Serpine1,扩增条件为63℃保温30min,扩增后产物通过特异性内切酶进行鉴定。结果RT-LAMP能特异性快速的扩增目的基因。结论RT-LAMP能因其特异,快速,高效的优点可以广泛运用于肿瘤转移相关基因的检测,对临床早期诊断提供标准。     

基于R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法的高危型人乳头瘤病毒基因型微量检测

  目的  使用R6G-ddATP作为双脱氧荧光底物建立单碱基末端延伸（SNaPShot）-凝胶荧光法快速检测3种高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）（HPV18、HPV33、HPV35）基因型。  方法  使用HPV质控品作为样本,R6G-ddATP双脱氧荧光试剂作为底物,首先利用通用引物对HPV进行扩增,得到第一轮扩增产物,经纯化后作为后续SNaPShot反应的模板;然后利用特异性的一步延伸引物进行SNaPShot反应,生成带有R6G荧光标记的DNA延伸产物;产物经过琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪下观察电泳结果,通过不同的一步延伸引物对HPV进行分型。每个样本均重复检测3次,并与DNA测序结果进行比较。  结果  优选的SNaPShot反应的退火温度为55℃;仅需3 h即可对HPV进行分型;在该最适条件下使用R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法检测3种HPV基因型,检测结果与测序结果一致。  结论  成功建立了3种HR-HPV基因型的微量检测方法——R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法,可用于HPV基因型的快速检测。     

血液细胞分析仪红细胞碎片参数检测性能评价

  目的  红细胞碎片（fragmented red cells,FRC）是全自动血液细胞分析仪提供的一项新的检测参数,其与血栓性微血管病等多种疾病密切相关,因此对血液细胞分析仪红细胞碎片的检测性能进行评价。  方法  通过携带污染率、精密度、线性、正确度、灵敏度、特异度等指标,对SYSMEX XN系列全自动血液细胞分析仪红细胞碎片的检测性能进行评价。所有数据采用 SPSS 19.0软件进行分析整理。  结果  SYSMEX XN系列全自动血细胞分析仪检测红细胞碎片的携带污染率为0.11%;批内精密度:各实验浓度下其变异系数（coefficient of variation,CV）分别为8.75%（FRC:42.15×109/L）、6.38%（FRC:83.42×109/L ）、4.57%（FRC:228.74×109/L）、5.31%（FRC:796.89×109/L）;线性验证:线性回归方程为Y = 1.0001X + 9.3288,相关系数为r = 0.9936;正确度验证:以人工镜检为标准,仪器法与其比较,差异无统计学意义（P > 0.05）,其相关系数为r = 0.82,灵敏度为92%,特异度为82%。  结论  SYSMEX XN系列全自动血液细胞分析仪检测红细胞碎片快速、简便,携带污染率低,精密度尚佳,线性范围满足要求,与人工镜检法相比具有较好的相关性,特异度和敏感度也较高。血液细胞分析仪可作为外周血红细胞碎片的快速筛查手段,但其检测的精密度仍需进一步提高,且由于方法的局限性,阳性标本需要在显微镜下进行确认。     

PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

背景　新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒（SARS-CoV-2）含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。目的　应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）原理,在Clin-ToF Ⅱ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱（PCR-TOF MS）系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。方法　2020年2-3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据。于2020年1-2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份（咽拭子样本55份、痰液样本25份）及健康人群样本20份（均为咽拭子样本）作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据。建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶（SAP）消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比（SNP）确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。结果　通过对PCR-TOF MS 模板条件的优化,模版量6 μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图。建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab（ORF1ab）基因和核壳蛋白（N）基因进行有效扩增检测。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR法的75.00%,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00%的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00%和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均未检出。结论　通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。     

RP-HPLC法测定诺氟沙星葡萄糖注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量

  目的  建立诺氟沙星葡萄糖注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量测定方法。  方法  选择色谱柱为（SHISEIDO C18-MGⅡ 5 μm 4.6×250 mm），流动相为乙腈:0.05 mol/L醋酸铵:水，流动相比例为70∶15∶15，流速为1.0 mL/min，进样体积为20 μL，柱温为35 ℃，检测波长为254 nm，采用三氯化铁和乙二胺四乙酸二钠反应形成螯合物后对其进行测定。  结果  乙二胺四乙酸二钠峰与其他色谱峰分离度良好；乙二胺四乙酸二钠在2.0326～200.3260 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（R2 = 0.9997），平均回收率为98.11%（n = 9）。  结论  该方法快速、简便、专属性强、精密度高、重复性好，结果准确可靠，适用于诺氟沙星葡萄糖注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量测定。     

血清GAD、ICA及 C-P联合检测对I型糖尿病的诊断价值

  目的  探讨I型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）患者血清谷胱氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase antibody,GAD）、胰岛细胞自身抗体（islet cell autoantibody,ICA）、C肽（C-peptide,C-P）水平变化对T1DM患者的临床诊断价值。  方法   回顾性分析楚雄彝族自治州人民医院2019年1月至2020年8月期间54例T1DM确诊患者检测的GAD、ICA、C-P数值,同时与在此期间来我院体检的50例正常人群进行分析对比。  结果  观察组GAD、ICA明显高于对照组;观察组C-P明显低于对照组,差异有统计学意义（P < 0.05）。GAD、ICA、C-P及3项共同检测用于T1DM诊断的AUC分别为0.927、0.840、0.956、0.993。其中GAD、ICA、C-P共同检测的ROC曲线下面积（AUC）最大,提示GAD、ICA、C-P联合检测的诊断效能高于GAD、ICA、C-P单独检测。  结论   GAD、ICA及C-P指标联合检测有利于提高T1DM诊断的灵敏度和特异度,对于T1DM的临床早期诊疗及预防预警评估具有突出作用。     

新生儿ABO溶血性黄疸检测C反应蛋白和降钙素原的临床意义

  目的  探讨检测C反应蛋白和降钙素原在新生儿ABO溶血性黄疸中的临床意义。  方法  选云南省某三甲医院2021年9月至2022年8月入院的ABO溶血性黄疸新生儿50例为观察组,同期的53例非溶血性病理性黄疸新生儿作为对照组,采用回顾性分析,对比分析2组患儿CRP、PCT水平、异常值检出率及感染发生率。  结果  观察组CRP水平[11.0000（9.1750,13.0025）]、PCT水平[0.6750（0.3175,2.9025）]、CRP异常值检出率（80%）、PCT异常值检出率（66%）、感染发生率（34%）均高于对照组CRP水平[1.5000（0.7000,7.5000）]、PCT水平[0.3200（0.2000,0.5850）]、CRP异常值检出率（41.5%）、PCT异常值检出率（32.1%）、感染发生率（11.3%）,差异具有统计学意义（P<0.05）;CRP诊断新生儿病情进展的ROC曲线下面积（AUC）为0.664,灵敏度为91.3%,特异度为46.2%;PCT的AUC为0.711,灵敏度为82.6%,特异度为60.0%。  结论  CRP、PCT在新生儿ABO溶血性黄疸中可见明显升高,对其检测可尽早发现新生儿的病情进展情况,确保临床及时采取有效的治疗护理措施,对促进新生儿的早期康复具有重要意义。     

云南省暗娼人群生殖道沙眼衣原体基因型分析

  目的  了解云南省暗娼人群中生殖道沙眼衣原体（chlamydia trachomatis,CT）的亚型分布情况及流行病学特征。  方法  2020年结合艾滋病哨点监测开展生殖道沙眼衣原体调查,收集生殖道沙眼衣原体核酸阳性样本374例,使用巢式PCR扩增CT的OmpA基因区并进行分析。  结果  在173个成功获得序列的样本中,共检测出7种基因型,其中以E型、F型、J型和D型为主要基因型,分别占24.9%（43/173）、21.4%（37/173）、19.1%（33/173）、17.9%（31/173）,其他包括G型（9.3%,16/173）、K型（4.6%,8/173）和H型（2.9%,5/173）。不同型别之间在调查地区、户籍、是否为边境州（市）、年龄、民族、文化程度、婚姻状况、样本来源和场所档次等特征上差异无统计学意义（P > 0.05）。  结论  云南省暗娼人群中存在多种的CT亚型,其分布在主要的人口学特征上无差异,可为进一步控制CT的传播提供指导,也可为将来治疗和疫苗研究提供基础信息。     

云南省部分地区婚检人群生殖道沙眼衣原体感染情况及相关因素

  目的  了解云南省部分地区婚检人群生殖道沙眼衣原体（chlamydia trachomatis,CT）感染情况,为制定防控措施以及效果评估提供依据。  方法  采用横断面调查,选取云南省保山市、德宏州、红河州、临沧市、普洱市和西双版纳州婚检人群进行问卷调查,并采集尿液/宫颈分泌物样本进行CT核酸检测。   结果  共纳入研究对象1671例,总的人群感染率为6.64%（111/1671,95%CI:5.40%～7.80%）。其中男性感染率4.99%（42/841,95%CI:3.50%～6.50%）,女性感染率8.31%（69/830,95%CI:6.40%～10.20%）。不同州市CT阳性率差异有统计学意义（P = 0.043）,其中普洱市、德宏州和临沧市的感染率较高,为8.87%（29/327）,8.64%（26/301）和7.94%（25/315）。年龄18～20岁（AOR = 4.346,95%CI:1.468～12.707）和文化程度为初中及以下的（AOR = 1.854,95%CI:1.071～3.211）更可能感染CT。  结论  云南省部分地区婚检人群中CT感染率具有地区、年龄和文化程度的差异。应加强性病防治知识的健康教育,进一步加强性病的检测能力,加大筛查力度和动员检测,尽可能地发现传染源,并进行规范化的治疗,以有效地控制生殖道沙眼衣原体的传播与流行。     

VI-RADS评分对膀胱癌精准治疗的价值

  目的  探讨VI-RADS评分在术前对膀胱癌侵袭性预测的价值。  方法  采用VI-RADS评分对320例膀胱癌MRI资料进行回顾性分析，对病灶的T2WI、DWI和DCE-MRI进行单独评分，最后获得VI-RADS评分，根据病理结果将样本分为NMIBC组和MIBC组，将VI-RADS评分与病理分期、VI-RADS评分与不同分组间进行相关性分析。  结果  肌层浸润性膀胱癌187例，非肌层浸润性膀胱癌133例，VI-RADS评分与病理结果存在正相关（r = 0.841，P < 0.001）。VI-RADS评分 > 3.5分对判断膀胱癌肌层浸润的敏感性、特异性分别为88.4%、97.1%。  结论  VI-RADS评分在术前对膀胱癌侵袭性的预测具有较好的敏感性和特异性，对指导临床治疗具有较好的价值。     

呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条快速检测方法的建立和评价

目的 采用聚合酶链式反应（PCR）技术和胶体金技术建立一种呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条检测方法,并对其检测效果进行评价。 方法 根据GenBank数据库选择真菌内转录间隔区（ITS）基因片段作为靶基因,应用DNAMAN软件对真菌ITS基因片段进行分析,并分别在真菌通用引物5'端用生物素（Biotin）和异硫氰酸荧光素（FITC）进行修饰标记;建立PCR体系,进行体系的最佳条件优化;确定胶体金免疫层析试纸条标记链霉亲和素的最佳标记量和质控线及检测线最佳包被物浓度,组装核酸胶体金试纸条,对试纸条的特异度、灵敏度、重复性和稳定性进行验证。 结果 水煮法提取白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌DNA,浓度为180 μg·L^－1以上,纯度为1.60~2.10;在pH 7.0条件下,每100 μL胶体金溶液中制备胶体金标记链霉亲和素最佳标记量为 3.3 μg,质控线包被Biotin化牛血清白蛋白（BSA-Biotin）浓度为2.00 g·L^－1,检测线包被抗FITC抗体浓度为1.00 g·L^－1。核酸试纸条的特异度与电泳结果一致,仅白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌出现阳性结果,与金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等常见呼吸道感染细菌无交叉反应。灵敏度检测,白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌的DNA浓度分别为10^－4、10^－2和10^－3 mg·L^－1时核酸试纸条仍可准确检出,而普通PCR电泳结果显示白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌最低检测浓度分别为0.01、1.00和0.10 mg·L^－1;重复性检测,在不同实验室不同操作人员对核酸试纸条进行验证,结果一致,重复性良好;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测,结果符合预期,稳定性良好。 结论 本研究建立的呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条可以检测白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌等真菌,特异度和灵敏度均较高,操作简便且快速。