受体特异性骨髓干细胞诱导肝移植大鼠长期存活的研究

目的 研究受体特异性骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化情况及对大鼠长期存活的影响.方法 雌性受体SD大鼠随机分成空白对照组、D-hanks液组、间充质干细胞组、造血干细胞组.空白对照组仅行原位肝移植术;D-hanks液组在肝移植术后大鼠门静脉注射D-hanks液0.5ml;间充质干细胞组在肝移植术后大鼠门静脉注射雄性SD大鼠骨髓问充质干细胞0.5ml(5×105个/mL);造血干细胞组注射骨髓造血干细胞0.5ml(5×105个/mL).观察大鼠的中位生存时间及术后60d Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测观察骨髓干细胞的分化情况.结果 间充质干细胞组、造血干细胞组中位生存时间分别为大于180 d、102d,较空白对照组、D-hanks液组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组又较造血干细胞组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组、造血干细胞组Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测呈阳性,且双阳性细胞百分率间充质干细胞组高于造血干细胞组(P＜0.05).结论 受体特异性骨髓干细胞能诱导大鼠肝移植术后长期存活,并能在移植肝的环境中诱导分化为肝细胞,表达白蛋白,并逐渐替代移植肝本身的细胞;间充质干细胞在移植肝内诱导分化为肝细胞并替代的能力较强;移植的肝脏被受体特异性骨髓干细胞分化来的肝细胞替代,是大鼠长期存活的可能原因.     

mdr-1基因骨髓造血干细胞移植诱导大鼠肝移植免疫耐受

目的 探讨mdr-1基因骨髓造血干细胞移植诱导肝移植术后免疫耐受的可行性及其可能机制.方法 选用雄性Wistar大鼠30只为肝移植供体,另选雌性SD大鼠20只为异基因肝移植受体,随机分为mdr-1基因骨髓造血干细胞移植联合肝移植组(A组)和单纯肝移植组(B组).雌性Wistar大鼠10只为同基因肝移植受体(C组).比较A、B两组大鼠肝移植术后1周生存率、生存状况、生存时间,以及移植肝脏的病理变化.结果 C组大鼠生存时间均达60 d以上,A组为(31.2±4.9)d,明显高于B组[(12.1±4.7)d],差异有统计学意义(P<0.05).B组病理组织切片可见中、重度急性排斥反应,肝内单核细胞浸润较为明显,主要集中在汇管区;A组移植肝内组织损伤程度明显减轻;C组基本无排斥反应,接近正常肝组织.结论 mdr-1基因骨髓造血干细胞可明显减轻大鼠肝移植后免疫排斥反应.     

输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的实验研究

目的 探讨输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的机制.方法 14只受体犬建立活体肝移植模型后,随机分为对照组和处理组,对照组仅做活体肝移植,处理组在活体肝移植的基础上,术中输注自体骨髓间充质干细胞,术后观察两组犬的生存时间、肝功能(AST、ALT)、组织病理变化及移植细胞的分化状况.结果 ①处理组比对照组的中位生存时间明显延长(P<0.01).②肝功能变化:术后两组AST、ALT总体相比较,处理组AST、ALT水平降低,有显著性差异(P<0.01).⑨组织病理变化:术后两组均出现不同程度的免疫排斥反应,且排斥程度相似.④移植细胞分化情况:输注的骨髓间充质干细胞向有功能的肝样细胞分化.结论 输注自体骨髓间充质干细胞可以延长活体肝移植受体犬的存活时间;经门静脉输注的自体骨髓间充质干细胞可向肝样细胞分化.     

腺病毒介导CD40Ig基因在大鼠肝脏移植中的作用

目的探讨腺病毒介导CD40Ig基因(AdCD40Ig)在大鼠肝脏移植中的作用。方法随机将供受体大鼠分4组,A:同基因移植组,B:免疫排斥组,C:AdLacZ对照组,D:基因治疗组。观察大鼠存活时间,CD40Ig、细胞因子水平和移植肝病理情况。结果 D组存活时间长于B、C组(P<0.05);CD40Ig浓度于术后7天达高峰;D、A组IL-2、IFN-γ水平较B、C组明显降低(P<0.05),D组IL-10较其他组明显增加(P<0.05);B、C两组术后出现中、重度排斥反应,汇管区淋巴细胞浸润明显,D组汇管区轻度炎症,无明显血管损伤证据,病理评级较B、C组有统计学意义(P<0.05)。结论 CD40Ig通过阻断CD40/CD40L通路,可延长移植肝存活时间,在受体内长期表达,减少汇管区淋巴细胞浸润,影响相关细胞因子的表达,对大鼠肝脏急性排斥反应有抑制作用。     

同期输注供者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫的影响

目的 探讨肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞对受体肝移植免疫的影响.方法 实验分为空白对照组(A组)、移植组(B组)和输注供者骨髓间充质干细胞组(C组).A组SD大鼠5只,只行剖腹探查,B,C组Wistar和SD大鼠各10只.行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取供体骨髓间质干细胞同期输注给受者,B组给予输注生理盐水.观察术后第7天肝功能的变化、病理改变和受体生存期.结果 肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞,ALT,AST,TBIL,ALB较B组显著降低,生存期明显延长,病理改变仅呈急性轻度排斥反应,而单纯移植组呈急性重度排斥反应.结论 肝移植同时输注骨髓间充质干细胞促进受体对移植肝的免疫耐受.     

人骨髓间充质干细胞移植对肝衰竭大鼠的治疗作用

目的:探讨体外诱导肝向分化成功后的人骨髓间充质干细胞经门静脉移植对肝衰竭大鼠肝功能及组织的影响。方法:人骨髓间充质干细胞传至第6代后,体外利用肝细胞生长因子(HGF)和上皮细胞生长因子(EGF)诱导其肝向分化。使用四氯化碳建立急性肝衰竭大鼠模型,随机分5组:HGF诱导分化细胞移植组、EGF诱导分化细胞移植组、HGF+EGF联合诱导移植组、无诱导细胞移植组和无细胞移植组,经门静脉移植人骨髓间充质干细胞,分别于移植后12 h、72 h、7 d、1月和2月时间点观察检测肝功能指标及肝脏病理的变化情况。结果:HGF诱导分化细胞移植组、EGF诱导细胞移植组、HGF+EGF联合诱导移植组、无诱导细胞移植组大鼠的生存情况、谷丙转氨酶、胆红素、白蛋白水平各指标较无细胞移植组均明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);但HGF诱导细胞移植组、EGF诱导细胞移植组和HGF+EGF联合诱导移植组各指标较无诱导细胞移植组,差异无统计学意义(P>0.05)。病理分析提示细胞移植组的大鼠肝显微结构较无细胞移植组改善明显。结论:肝向分化的人骨髓间充质干细胞移植入肝衰竭大鼠体内能够显著改善肝功能。     

IDO基因转染延长同种异基因大鼠移植心脏的存活

目的:了解逆转录基因载体介导的吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)基因转染能否延长同种异基因大鼠移植心脏的存活时间及机理。方法:把同种异基因大鼠心脏移植模型(Lewis→BN)分成4组,A组为对照组,同种异基因大鼠心脏移植(Lewis→BN);B组:IDO基因转染后的供体心脏移植给受体大鼠;C组:空载体转染供体心脏,再移植给受体大鼠;D组:同种异基因大鼠心脏移植 CsA组(CsA5mg/kg/d×7天)。观察记录移植心脏的存活时间及术后6天组织病理学检查明确排斥反应的诊断和分级,RT-PCR检测术后6天移植心脏TNF-α的mRNA表达,FCM检测外周血活化的T细胞(CD3 CD25 )、有核细胞CD86 表达等方法探讨其机理。结果:A、B、C、D组移植心脏平均存活时间为7.2±0.45、13.2±2.16、7.1±0.62和15.6±3.21天,其中B、D组术后6天CD3 CD25 、有核细胞CD86 表达、供心组织急性排斥反应的强度和TNF-α的mRNA表达较A、C组显著降低(P<0.05),A、C组具有典型重度急性排斥反应特征而B、D组最轻。结论:逆转录基因载体介导的IDO基因转染能够延长移植心脏存活时间的作用,其机理包括抑制反应性T细胞、抑制有核细胞共刺激信号CD86表达、抑制心肌组织表达TNF-α等。     

ＨＯ-１持续高表达对ＤＡ到Ｌｅｗｉｓ大鼠肝移植急性排斥反应的影响

目的:探讨血红素氧化酶-1(hemeoxygenage-1,HO-1)在DA到Lewis大鼠肝移植中对急性排斥反应的影响及其机制.方法:建立DA到Lewis大鼠肝移植急性排斥模型,实验分3组,各12对.A组供体术前24 h阴茎背静脉注射5ml/kg生理盐水作为对照;B组供体术前24 h阴茎背经脉注射HO-1诱导剂钴原卟啉(CoPP),C组供体给予HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP),移植后持续予相同处理直至受体死亡.术后7天,各组处死6只,取外周血及肝脏标本,测定血清ALT,DBIL水平,组织病理观察排斥反应程度,RT-PCR及Western blot法测定移植物内HO-1 mRNA,Foxp3 mRNA及其蛋白表达情况,余观察生存期.结果:术后7天,B组血ALT,TBIL水平与A组,c组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);病理示B组移植肝排斥反应程度轻于A,C组;B组HO-1和Foxp3 mRNA及其蛋白的表达均强于A,C组;B组受体存活时间(29.83±1.40)天较A组(13.00±0.52)天与C组(11.67±0.42)天显著延长(P＜0.01),而A,C组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:诱导移植肝HO-1持续高表达,可通过促进移植物内Foxp3表达增强,发挥免疫抑制作用,减轻移植肝急性排斥反应.     

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。     

外周血单个核细胞CXCR3 mRNA表达与大鼠心移植急性排斥的关系

目的探讨外周血单个核细胞(PBMC)趋化因子受体CXCR3mRNA动态变化与大鼠心移植急性排斥的关系及其在早期诊断中的价值。方法以Wistar和SD大鼠作为供体,SD大鼠作为受体,建立腹部异位心脏移植模型,按移植前后处理方法不同随机分3组:A组为SD大鼠同基因移植对照组,移植前后未作处理;B组为Wistar-SD急性排斥组,移植前后未作处理;C组为Wistar-SD异基因移植治疗组,移植日开始给予环胞素A(CsA)5mg/kg/d腹腔注射×14d。术后第1、3、5、7d分批处死,采用实时定量PCR检测PBMC的CXCR3mR-NA表达,并对心肌进行病理组织学检查,每组留5只用于观察生存期。结果A组大鼠移植心存活时间均大于100d,B、C组分别为(7.40±1.14)d、(24.00±2.35)d,C组较B组存活时间明显延长(P<0.01),A组较B、C组存活时间更长(P<0.01)。A组各时间点均未发生排斥反应,PBMC的CXCR3mRNA呈低水平表达;B组术后PBMC的CXCR3mRNA动态变化与急性排斥反应的进程呈正相关,术后5d PBMC的CXCR3mRNA表达上调至峰值4.30±0.82;C组经环胞素A治疗后排斥反应发生率明显下降,各时间点PBMC的CXCR3mRNA表达明显低于B组,术后7d达到峰值1.50±0.76,与B组相比差异具有显著性(t=7.08,P<0.01)。结论PBMC的CXCR3mRNA表达与排斥反应密切相关,提示可作为诊断急性排斥反应或者观察抗排斥反应疗效的指标。     

自体骨髓间充质干细胞对异基因猪移植肝的保护作用

摘要 目的 研究自体骨髓间充质干细胞术中经门静脉输注对异基因小型猪移植肝脏的保护作用.方法 建立异基因猪肝移植急性排斥反应模型, 实验分对照组和处理组,对照组只做原位肝移植,处理组在原位肝移植的基础上,术中经门静脉注射一定数量预先制备的受体自身骨髓间充质干细胞,术后1d,3d,6d静脉采血检测肝功能,并做肝组织的病理活检 ,并观察受体的生存时间. 结果 1、处理组中受体的生存时间明显比对照组的延长P<0.001。2、肝功能变化：术前两组血清AST、ALT比较尚无统计学差异（p>0.05），术后处理组受体血清中AST,AL T总体变化明显低于对照组,两组比较有显著的统计学差异P<0.01；3、组织病理变化：处理组在术后7天病理活检见：大致呈正常肝脏病理, 肝组织轻度淤血，血管周围少量炎性细胞浸润, 少数汇管区小静脉或肝静脉内皮细胞下淋巴细胞浸润，肝细胞点状坏死，中性粒细胞浸润. 而对照组在术后3天移植的肝脏中出现汇管区大量炎症细胞聚集，肝细胞浑浊，气球样变性并出现不同程度的点状、灶状坏死。结论 自体骨髓间充质干细胞经门静脉输注能够保护移植的肝脏，延长受体的存活时间.     

大鼠肝移植术后受体骨髓间充质干细胞输注肝内示踪与标记方法比较

目的 采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester, CFSE)与溴化脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)两种细胞标记物观测肝移植术后受体骨髓间充质干细胞(MSCs)肝内分布情况.并对两种方法进行比较.方法 在已构建的DA-Lewis大鼠原位肝移植模型及提取培养Lewis大鼠MSCs的基础上分别用CFSE和Brdu对Lewis来源的MSCs进行标记,术中经门静脉输注,通过荧光显微镜和免疫组织化学法观测术后2mo内各时间点受体肝组织内MSCs的分布情况.结果 CFSE细胞标记率约为(94.1±1.4)%.受体肝组织第1、7、14天内有CFSE标记的MSCs聚集.对照组第5天肝组织内发布的CFSE标记MSCs消失.BrdU细胞标记率约为(90.3±3.5)%.受体肝组织第14天、1个月、2个月可见Brdu阳性的MSCs分布,对照组相应时间点肝组织内未发现Brdu阳性的MSCs.结论 CFSE和Brdu均为MSCs的良好标记物.CFSE标记细胞后荧光迅速减弱,适用于短期示踪.Brdu标记细胞后可维持较长时间,适用于长期示踪.两种标记方法均是MSCs较为简单有效的方法,实验显示受体MSCs大部分分布于移植肝脏.     

外周血淋巴细胞LFA-1水平与肝移植急性排斥的关系

【目的】探讨大鼠原位肝脏移植(OLTx)后外周血淋巴细胞表面淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）与急性排斥的关系。【方法】实验动物分为两组,非排斥对照组供体、受体均为SD大鼠,各20只,排斥组供体为Wistar大鼠,受体为SD大鼠,各20只。受体大鼠分别于原位肝移植术前1天及术后第1、3、5、7天从尾静脉采血,经免疫荧光抗体-流式细胞术检测淋巴细胞表面LFA-1的表达。【结果】原位肝移植术后,受体大鼠外周血淋巴细胞LFA-1呈低水平表达,与术前相比差异具显著性意义（P<0.01）;受体大鼠发生急性排斥反应时,外周血淋巴细胞LFA-1水平显著增高,与对照组相比差异具显著性意义（P<0.01）。【结论】检测外周血淋巴细胞LFA-1表达水平有助于移植肝脏急性排斥的诊断。     

不同途径移植间充质干细胞对大鼠急性肝损伤的修复作用

目的:评价骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠急性肝损伤的修复作用,探讨其可行性和有效性.方法:四氯化碳(CCl4)腹腔注射复制Wistar大鼠急性肝损伤模型,造模后随机分为实验组及对照组,实验组分别通过尾静脉、门静脉、肝内注射移植经Hochest33342标记的大鼠骨髓MSCs悬液0.5 mL(约1×10 6个细胞...     

骨髓干细胞治疗大鼠急性肝损伤效果的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓干细胞移植治疗急性肝损伤的疗效.方法 取50只正常雄性大鼠,采用2-乙酰氨基芴和四氯化碳溶液灌胃,制成急性肝损伤模型,取其骨髓,以淋巴细胞分离液分离出于细胞,再用荧光染料(PKH26)进行标记.将50只急性肝损伤大鼠分为实验组和对照组,每组25只.实验组大鼠麻醉后,取腹部正中切口,经门静脉注入自体骨髓干细胞悬液0.4 mL(4×106个).移植术前及术后3d、7d、14 d、4周观察血清转氨酶(ALT、AST)、总胆红素(TB)、凝血酶原时间(PT)和白蛋白(ALB)水平变化;骨髓干细胞移植后4周,取各组肝脏组织,制成冰冻切片,用异硫氰荧光素标记的抗体进行免疫组织化学染色,检测其PKH26标记阳性细胞.结果 术后3、7d,各项肝功能指标无显著性差异(P＞0.05);术后14 d ALT、AST及ALB有所改善(P＜0.05),其余指标无明显改善;4周各项肝功能指标均有改善(P＜0.05).大鼠肝脏切片中可见散在的PKH26染色阳性的红色荧光,PKH26染色阳性细胞数为(57.2±6.18)个,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经门静脉注入的骨髓干细胞能定植于肝脏,是治疗急性肝损伤的一种安全有效的方法,可显著改善急性肝损伤大鼠肝功能.     

骨髓间充质干细胞对SD大鼠离体肝切除自体肝移植肝功能的保护作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠离体肝切除自体肝移植肝功能的保护作用,寻找可能的机制。方法采用生化、TUNEL、Western blot等方法检测离体肝切除自体肝移植术后大鼠不同时间点的血清及肝脏组织标本。取SD大鼠骨髓体外培养BMSCs,纯化后GFP标记,第3代做检测并配置成细胞悬液,建立SD大鼠离体肝切除自体肝移植模型,分为BMSCs注射组(BMSCs悬液门静脉注入)和生理盐水注射组(等量生理盐水门静脉注入)行离体肝切除自体肝移植手术,观察术后大鼠状态,检测大鼠肝功能、肝细胞凋亡,TGF-β1及Bcl-2、bax表达情况。结果成功分离培养BMSCs并鉴定。BMSCs注射组术后大鼠死亡率低于生理盐水注射组,BMSCs注射组术后12、24、48、72 h肝功能明显好于生理盐水注射组,肝细胞凋亡率低于生理盐水注射组。BMSCs注射组TGF-β1、bax水平较生理盐水注射组减少,Bcl-2较生理盐水注射组增高,其中bax下调、Bcl-2上调有显著性差异(P<0.05),而TGF-β1在24、72 h无显著性差异。结论BMSCs能通过直接门静脉注射入肝改善离体肝切除自体肝移植大鼠术后肝功能,其可能通过影响Bcl-2/bax值减少肝细胞凋亡,可能是通过TGF-β1无关的其他途径。     

预输注供者凋亡淋巴细胞对大鼠肝移植免疫排斥的影响

目的 探讨供者凋亡淋巴细胞对大鼠原位肝移植免疫排斥的影响.方法 用荧光标记供者(SD大鼠)脾淋巴细胞,诱导凋亡后,经尾静脉输入受者Lewis大鼠,观察荧光细胞在体内分布.取SD大鼠脾淋巴细胞诱导凋亡后输入Lewis大鼠,7 d后行大鼠SD-Lewis原位肝移植,观察术后第7天肝功能(ALT、TBiL) 的变化、病理改变...     

稳定大鼠肝移植模型的规范及移植肝灌注方式比较

目的总结建立大鼠原位肝移植稳定模型的规范和提高成功率的措施,比较经门静脉灌注和经腹主动脉灌注对移植肝功能的影响。方法手术显微镜下,用改良的二袖套法进行100例大鼠原位肝移植,并依据灌注方式分组:经门静脉灌注和经腹主动脉灌注组(n=50)。检测术后肝功能,观察组织病理学改变、术后生存率以及手术并发症。结果两组组织病理学表现相同。手术成功率分别为98%(49/50)和96%(48/50),3月存活率分别为93.5%(29/31)和93.3%(28/30),术后肝功能、手术成功率和3月存活率差异无显著性(P>0.05)。结论供肝经门静脉灌注和经腹主动脉灌注均可采用,应根据研究目的选择适当肝移植模型。熟练的显微外科技术、规范细致的手术操作、缩短无肝期时间是提高成功率、减少术后并发症的关键。