慢性乙型肝炎患者病毒载量与IFN-γ、IL-10、CD19~(+)水平的相关性

目的探讨IFN-γ、IL-10、CD19+水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量的相关关系。方法收集感染科2012年6月到2014年2月的门诊及住院的慢性乙型肝炎患者80例,同时选取在我院体检正常或者非肝炎病毒感染患者50例作为对照组,荧光定量PCR法定量病毒载量,酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体法检测IFN-γ、IL-10水平及荧光染色测定CD19+水平,分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平与HBV DNA定量相关关系。结果病例组的IFN-γ水平低于对照组,而IL-10与CD19+高于对照组中的水平,差异具有统计学意义(P0.05)。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA阴性、低拷贝、高拷贝间差别具有统计学意义(P0.05),其中高拷贝与低拷贝组中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA阴性组中水平,IFN-γ低于HBV DNA阴性组中的水平,差异具有统计学意义(P0.05),高拷贝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平与低拷贝间差别具有统计学意义(P0.05)。IFN-γ与HBV DNA定量间呈负相关关系(r=-0.367,P0.05),IL-10和CD19+水平与HBV DNA定量间呈现正相关关系(IL-10 r=0.362、CD19+r=0.348,P0.05)。结论 IFN-γ水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量呈现负相关关系、IL-10、CD19+水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量间呈现正相关关系,因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作为乙型肝炎患者发生炎症特异指标。     

外周血单个核细胞IFN-γmRNA的测定及应用

目的 研究鸭IFN—γ(DuIFN-γ)在感染及控制病毒过程中的作用和机制。方法 基于β—actin的高度保守序列设计引物，通过RT—PCR方法获得了β—actin的部分cDNA为看家基因，然后构建DuIFN-γ靶片段的竞争性内参照，建立检测DuIFN—γ基因转录的半定量竞争性RT—PCR方法。结果 建立了检测DuIFN-γ基因转录的半定量竞争性RT—PCR方法，并检测了在PHA刺激下鸭外周血单核细胞IFN-γmRNA动态变化，结果表明PHA刺激24～36h，DuIFN-γmRNA转录量最高。以此方法对用DHBVpreSDNA或与IFN-γ7DNA共免疫DHBV感染鸭进行了测定，结果表明IFN-γ表达质粒作为DNA免疫佐剂，可以增强宿主IFN-γ的应答。结论IFN-γ表达质粒为DNA疫苗的有效佐剂。DuIFN-γ基因转录的半定量竞争性RT—PCR方法为研究鸭IFN-γ在DHBV感染及清除中的作用和机制奠定了基础。     

实时相对定量反转录PCR检测小鼠阴道黏膜炎症因子的表达

目的建立实时相对定量反转录聚合酶链反应(real-time RQ RT-PCR)方法,能快速准确地检测各种炎症因子在阴道黏膜的转录表达情况,从而评价包括杀微生物剂在内的生殖道或直肠黏膜用候选药物的刺激毒性。方法以Eppendorf Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪为检测平台,选择小鼠β-actin基因为内参,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的real-time PCR检测方法,对白介素2(Interleukin 2,IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、γ干扰素(Interferonγ,IFN-γ)等炎症因子在生殖道黏膜的mRNA转录水平,同时进行检测,并用2-⊿⊿Ct方法计算实验组小鼠目的基因相对于空白组小鼠的表达差异情况。用微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)对结果进行验证。结果使用real-time RQRT-PCR能对小鼠阴道黏膜炎症因子的表达情况进行快速检测,结果与CBA检测结果相吻合。结论该方法快速、灵敏、特异性强、价格低廉、高通量。可用于杀微生物剂等生殖道或直肠黏膜用候选药物的临床前安全性评价工作。     

乙型肝炎肝硬化患者外周血IFN-γ、IL-32和IL-6的临床相关性

目的探讨乙肝肝硬化患者外周血IFN-γ、IL-32和IL-6水平的临床相关性。方法收集42例乙型肝炎肝硬化患者和50例健康对照者空腹血清,采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-32和IL-6水平;采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA载量;采用全自动生化分析仪检测血清肝功能水平。结果健康对照者血清IFN-γ、IL-32和IL-6水平分别为(14.41±3.71)、(182.24±72.22)、(1.62±0.63)ng/mL,乙肝肝硬化患者分别为(182.12±41.37)、(1218.21±215.08)、(37.70±9.77)ng/mL。IFN-γ水平与ALb水平呈负相关(r=-0.342,P0.05),与HBV DNA水平呈正相关(r=0.319,P0.05);IL-6水平与ALT水平呈负相关(r=-0.314,P0.05)。结论 IFN-γ、IL-32和IL-6在慢性HBV感染过程中可能起重要作用,可作为评估慢性乙型肝炎病情严重程度的重要指标。     

呼吸道合胞病毒肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达变化及其临床意义

目的 探讨呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎患儿外周血单个核细胞干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)、干扰素诱导蛋白27(IFI27)表达变化及其临床意义。方法 选择RSV肺炎患儿90例（观察组），其中病情程度低危28例、中危30例、高危32例，选择同期腹股沟斜疝患儿40例（对照组），采集所有研究对象外周静脉血，采用荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达，采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ，采用肺功能检测仪检测第1秒用力呼气容积占预计值的百分比（FEV1%pred）、FEV1/用力肺活量（FVC）。采用Pearson相关分析法分析RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC的关系。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达对RSV肺炎的诊断价值。结果 观察组外周血单个核细胞IFITM3、IFI27相对表达量及血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均显著高于对照组，FEV1%pr...     

巨细胞病毒肺炎肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6的水平观察

目的检测巨细胞病毒(MCMV)肺炎小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞因子IFN-γ、IL-6的水平,观察其水平变化并探讨临床意义。方法建立MCMV肺炎模型,HE法观察肺组织病理,PCR及凝胶电泳法检测MCMV-DNA,ELASA法测定IFN-γ、IL-6的水平。结果 MCMV肺炎组病理提示为间质性肺炎,更昔洛韦治疗后炎症有减轻;MCMV肺炎组小鼠的肺组织及BALF中均存在MCMV-DNA;较B组,C组IFN-γ水平下降,IL-6升高,而更昔洛韦治疗后,IFN-γ上调,IL-6降低,这两细胞因子在肺组织及BALF中的变化趋势一致,且各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论检测肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6的水平变化对临床诊断、治疗及预后有一定的指导价值。     

苦参素治疗慢性乙型肝炎相关细胞因子的变化

目的研究苦参素治疗慢性乙型肝炎前后血清肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干扰素γ（interferon-1,IFN-1）、白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素12（interleukin-12,IL-12）、白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）水平的变化。方法根据治疗结果,将56名患者分为3组：完全应答组、部分应答组和无应答组。检测患者治疗前及治疗3、6个月时血清TNF—α、IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-18水平。结果治疗3个月时血清TNF-α、IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-18水平达到最高,其后逐渐下降,治疗6个月时大部分低于治疗前水平。结论用苦参素治疗慢性乙型肝炎患者,早期观察其血清TNF—α、IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-18的变化对疗效及预后有-定的预测作用。     

白细胞介素-17A在原发性干燥综合征发病中的作用探讨

目的探讨IL-17A对pSS患者炎性因子和PBMCs自噬基因的调控作用。方法选择符合pSS诊断的患者30例, 抽取20 ml外周血, 分离PBMCs, 分为PBMCs组、IL-17A刺激剂组和IL-17A抑制剂组, 温育48 h后, 应用免疫荧光检测微管相关蛋白l轻链3(LC3)自噬小体, ELISA法检测炎性因子IL-4、IFN-γ、IL-13的表达, 实时荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)检测自噬诱导基因Ambra-1、Bif-1和凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL mRNA的表达, 免疫蛋白印迹法检测苄氯素1(Beclin1)和LC3蛋白表达。采用方差分析比较组间差异, 两两比较采用t检验。结果免疫荧光结果显示, 与IL-17A刺激剂组比较, IL-17A抑制组LC3自噬小体明显增多。ELISA结果显示, 与PBMCs组[IL-4分泌量(13.39±0.32)pg/ml, IFN-γ分泌量(14.4±0.4)pg/ml, IL-13分泌量(854±36)pg/ml]比较, IL-17A刺激组IL-4分泌量(11.54±0.30)下降(t=12.83, P=0.024), IFN-γ...     

贝类奥尔森派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的用于检测贝类奥尔森派琴虫的实时荧光定量PCR方法。方法根据基因库中奥尔森派琴虫的基因保守序列,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,对采自广西沿海的49份贻贝标本进行检测,并与常规PCR比较。结果建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达20个拷贝,比常规PCR灵敏度高100倍。49份贻贝标本的阳性率为16.3%,检测的奥尔森派琴虫基因组DNA含量为2.38×10^6～9.21×10^2拷贝/μl。结论建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类奥尔森派琴虫感染的快速检测。     

慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎3种血清细胞因子表达及意义

目的分析慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎患者血清γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-10（IL-10）的表达及临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎患者（重叠组）、急性戊型肝炎患者（AHE组）、慢性乙型肝炎患者（CHB组）和健康体检者（对照组）的血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平;分别采用实时荧光PCR和ELISA方法测定重叠组和CHB组的乙肝病毒（HBV）基因定量（HBV DNA）和HBV血清标记物;同时检测重叠组、AHE组和CHB组的主要肝功能指标。结果 重叠组IFN-γ高于CHB组和对照组,IL-10低于CHB组和对照组,IL-2高于CHB组（P〈0.05）;CHB组IL-10高于其他3组（P〈0.05）。重叠组丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBIL）高于CHB组,胆碱酯酶（CHE）、白蛋白（ALB）、凝血酶原活动度（PTA）低于CHB组（P〈0.05）。重叠组乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HBV DNA阴性率高于CHB组（P=0.00）。重叠组组中HBV-DNA阴性者IFN-γ、IL-2水平高于HBV-DNA阳性者,IL-10水平低于HBV DNA阳性者（P〈0.01）。结论 IFN-γ、IL-2、IL-10参与慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎肝细胞免疫损伤过程;IFN-γ、IL-2、IL-10可作为判断重叠感染后肝细胞损伤程度的指标;重叠感染后IFN-γ、IL-2可能影响HBV的复制。     

泡球蚴感染小鼠IL-17基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立与检测

目的建立检测泡球蚴感染小鼠IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。方法通过腹腔注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,感染1个月后处死,提取肝脏总RNA,反转录得到cDNA;登陆GenBank,得到IL-17基因(U43088.1)全序列,选取保守序列,应用pri mer 5设计引物,β-actin作为内参,以10倍梯度稀释IL-17 PCR产物为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR以确定方法的特异性和灵敏度;绘制标准曲线,确定IL-17基因检测的最佳条件。结果用建立的实时定量RT-PCR检测IL-17基因无非特异性扩增,各样品熔解温度均在81.0℃,熔解峰单一;mRNA检出限为1×102pg,106~102pg总RNA均有扩增;泡球蚴感染1个月后,IL-17基因表达显著增加,感染组和对照组分别为(0.008728±0.000984)和(0.003823±0.00082),差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了小鼠源IL-17基因实时定量RT-PCR检测体系。经检测,小鼠感染泡球蚴1个月后IL-17基因表达增加,表明IL-17在泡球蚴感染免疫调节...     

细胞因子IL-1β/ IFN-γ对骨骼肌成肌细胞基因表达的影响

目的研究细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)/干扰素-γ( IFN-γ)对鼠骨骼肌成肌细胞基因表达的影响.方法鼠骨骼肌成肌细胞在IL-1β/ IFN-γ混合液中孵育12 h,用抑制性削减杂交法克隆差异表达基因.随机挑取抑制性削减杂交所得克隆制备质粒,进行PCR扩增, 选取不同长度片断的产物,测序分析.结果发现1种骨骼肌结构蛋白基因(原肌球蛋白-4)表达下调,另发现2种凋亡相关的基因和2种功能不明基因的表达上调.结论①IL-1β/ IFN-γ下调骨骼肌结构蛋白基因,调节凋亡相关基因表达,推测可能是骨骼肌功能失调的原因之一;② 2种功能不明基因的表达为进一步研究骨骼肌功能失调的原因提供了新线索.     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

自身免疫性甲状腺疾病Th1/Th2相关细胞因子不同极化方向漂移的研究

目的探讨自身免疫性甲状腺疾病（AITD）发病的始动原因，明确AITDTh，／Th：相关细胞因子群谱的特征。方法用逆转录酶链聚合反应方法检测IFN-γ、TNF—α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等6种细胞因子的mRNA表达。结果与正常对照组相比，Graves病（GD）和桥本甲状腺炎（HT）细胞因子表达率明显增加；GDTh2类细胞因子IL-4和IL-6总表达频率明显高于Th1类细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2表达频率，他巴唑治疗前后GD细胞因子Th2强势的表达特征没有明显变化，但总的细胞因子的表达频率下降；HT Th1类细胞因子IFN-γ、TNF—α和IL-2表达频率高于Th2类细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的表达频率。结论GD细胞因子表达向Th2方向漂移，以体液免疫为主；他巴唑治疗后的GD细胞因子谱没有明显改变，而HT细胞因子表达则呈现Th1强势，以细胞免疫为主。     

雷公藤多甙对NOD小鼠1型糖尿病免疫治疗的机理

目的观察雷公藤多甙（TWP）对雌性非肥胖型糖尿病小鼠（NOD小鼠）1型糖尿病免疫预防作用并初步讨论其机理。方法采用NOD小鼠环磷酰胺加速发病,给TWP后观察糖尿病发病率、半定量RT—PCR分析胰腺组织干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（INF—α）、白介素-10（IL-10）mRNA的表达。结果TWP组实验结束时糖尿病发病率（43．33％）低于对照组（71．43％）（P〈0．05）;胰腺组织IFN-γ、TNF—α mRNA的表达降低（P〈0．01）,IL-10 mRNA的表达无明显改变。结论TWP可预防NOD鼠糖尿病的发生,其机制可能与下调胰腺组织Th1细胞因子表达有关。     

HBV C基因基本核心启动子变异对乙型肝炎患者血清病毒复制和细胞因子水平的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）DNAC基因基本核心启动子（BCP）变异对机体免疫状态及乙型肝炎病毒复制的影响。方法采用PCR微板核酸杂交结合ELISA技术检测HBVDNABCP变异；采用双抗体夹心ELISA法检测患者血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平；采用荧光定量PCR法测定HBVDNA水平。结果HBVDNABCP变异病人和非变异病人血清IL-2水平分别为61．4±24．7ng／L和65．1±25．3ng／L，IFN-γ为82．0±50．1ng／L和71．8±67．0ng／L，IL-4为62．3±46．0ng／L和59．4±51．0ng／L．IL-10为74．0±88．2ng／L和81．4±67．0ng／L（P均〉0．1）；HBVDNABCP变异病人的HBVDNA水平为1×10^5.82±2.01 copies／ml，明显高于非变异病人的1×10^4.71±1.78 copies／ml（P〈0．01）。结论HBVDNABCP变异对机体血清细胞因子水平无明显影响，但对HBVDNA的复制具有一定的促进作用。     

淋巴细胞转输对线粒体腺苷酸转位酶诱导的自身免疫性心肌病小鼠细胞因子的抑制作用

目的:研究淋巴细胞转输对线粒体腺苷酸转位酶(ANT)合成肽诱导的自身免疫性心肌病传染性耐受的小鼠Th1/Th2亚群及血清和心肌组织细胞因子的影响。方法:用ANT多肽多次免疫Balb/C小鼠得到心肌病组,单抗组小鼠在给予ADP/ATP肽免疫的第0、1和2天,同时接受尾静脉注射400μg抗L3T4单抗;第6个月末时,将单抗组小鼠的脾细胞取出转输到正常小鼠体内(转输组),此小鼠亦同时给予多肽免疫,方法同心肌病组。对照组以不含ANT的相同免疫进行假性免疫,时间和剂量同心肌病组。采用流式细胞术检测脾T细胞内细胞因子IFN-γ/IL-4的含量;以ELISA法检测其血清中IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;实时荧光定量PCR法检测其心肌细胞因子mRNA表达。结果:转输组Th细胞IFN-γ、IL-4含量与对照组和单抗组接近且明显低于心肌病组;转输组小鼠血清IFN-γ和IL-2水平明显高于心肌病组而低于单抗组,IL-4和IL-6水平显著低于心肌病组;TNF-α水平在转输组则最高;心肌细胞因子mRNA的表达则转输组显著低于心肌病组,与对照组和单抗组相近。结论:淋巴细胞转输能够阻断心肌病诱导过程中绝大部分细胞因子的生成,与单抗早期干预的结果类似。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

慢性乙型肝炎患者HBVDNA载量与PMBC分泌IFN-γ、IL-6水平相关性研究

目的探讨不同HBVDNA载量慢性乙型肝炎（CHB）患者经拉米夫定治疗前后外周血单核细胞（PM-BC）分泌IFN-γ、IL-6水平变化规律及其临床意义。方法血清HBVDNA载量采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）测定,PMBC分泌IL-6、IFN-γ水平采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）测定。结果治疗前CHB患者IFN-γ水平显著低于正常对照组（P〈0.01）,IL-6水平显著高于正常对照组（P〈0.01）;拉米夫定治疗后HBV高、中载量组IFN-γ水平较治疗前显著升高（P〈0.01和P〈0.05）,IL-6水平较治疗前显著降低（P〈0.01和P〈0.05）,治疗后中、低载量组IFN-γ水平仍低于正常对照组（P〈0.01）,IL-6的水平高于正常对照组（P〈0.01）;患者INFγ水平变化与HBVDNA载量呈负相关（r=0.89,P〈0.001）,IL-6水平变化与HBVDNA载量和ALT呈正相关（分别为：r=0.92,P〈0.001;r=0.74,P〈0.001）。结论不同HBVDNA载量CHB患者经拉米夫定治疗应答与IFN-γ、IL-6水平程度有关,IFN-γ和IL-6的含量能较好的反映TH1/TH2的水平,且可以作为CHB疗效参考指标。     

内参照基因在实时荧光定量RT-PCR检测中的应用

目的 建立测定内参照β-actin表达量的实时荧光定量RT-PCR两步法检测方法.方法 根据Genbank 中人β-actin保守区域序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的特异性和重复性.结果 建立了人β-actin实时荧光RT-PCR检测方法.结论 本实验建立的人β-actin表达实时荧光RT-PCR两步法检测方法特异性和重复性较好,为β-actin作为定量RT-PCR中内参照基因进行人其他功能基因和病原基因表达的定量分析奠定了基础.