反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

为了解丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因调控方式、探索反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的体外抑制作用。构建了由ＨＣＶ５′非翻译区（５′ＵＴＲ）翻译启动报道基因－虫荧光素酶（ｌｕｃ）基因的真核表达载体；人工合成了针对ＨＣＶ５′ＵＴＲ及非结构蛋白５（ＮＳ５）区的反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）。借助脂质体将ＯＤＮ分别与所构建的载体一同转染人癌细胞系，短期培养后制备细胞提取液，以荧光发光法检测ｌｕｃ基因的表达．     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达

目的　体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ） 基因变异的生物学意义。方法　应用逆转录病毒载体ｐＸＴ１ 构建ＨＢＶ／Ｃ 基因表达载体,并转染永生化人外周血Ｂ 细胞使之稳定表达ＨＢｃＡｇ。结果　重组质粒ｐＸＴ１ＨＢＶ／Ｃ 经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性,转染后的永生化人外周血Ｂ 细胞ＰＣＲ 鉴定含目的ＤＮＡ,流式细胞仪分析显示,约４７ ．４ ％ 的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论　ＨＢＶ／Ｃ基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中稳定表达,有利于系列研究ＨＢＶ／Ｃ基因变异的生物学意义。     

核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用

目的观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对ＨＢｅＡｇ在细胞内表达的抑制作用．方法利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人ＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）,观察该核酶在细胞内对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用．结果在人ＨＣＣ细胞中ｐ１．２Ⅱ可表达出ＨＢｅＡｇ;该核酶对ＨＢｅＡｇ的合成抑制率达６５％．结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制了ＨＢｅＡｇ的合成     

乙型肝炎病毒C基因变屉对人白细胞抗原表达的影响

目的 阐明我国常见的ＨＢＶ／Ｃ变异对宿主细胞人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）表达的影响。方法 构建携带野生型和变异型ＨＢＶ／Ｃ基因的真核细胞表达载体，转染ＨｅｐＧ２细胞，鉴定目的基因在宿主细胞中的表达，检测ＨＬＡ－１，ＨＬＡ－ＤＲ在宿主细胞膜上的表达。结果 ＰＣＲ和Ｗｃｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析能分别检测到目的ＤＮＡ片段和ＨＢｃＡｇ的表达，约１００％的ＨｅｐＧ     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周？…

目的体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）基因变异的生物学意义。方法 应用逆转 录病毒勒体ＰＸＴ１构建ＨＢＶ／Ｃ基因表达载体，并转染永生化人外周血Ｂ细胞使之稳定ＨＢｃＡｇ。结果 重组质粒ＰＸＴ１－ＨＢＶ／Ｃ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血Ｂ细胞ＰＣＲ鉴定含目的ＤＮＡ，流式细胞仪分析显示，约４７．４％的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论ＨＢＶ／Ｃ基因逆转     

核酶对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的定量观察双位点核酶对细胞内ＨＢＶ基因表达的抑制作用。方法构建针对ＨＢＶＣ区双位点核酶的真核表达载体（ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ）,将该质粒与ｐｌ．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人肝细胞癌（ＨＨＣＣ）细胞株,对转染细胞所表达ＨＢｅＡｇ进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。结果共转染细胞可以表达ＨＢｅＡｇ,同对照组相比,核酶组荧光量明显下降。结论在核酶与ＨＢＶ共转染细胞中,核酶通过对ＨＢＶｍＲＮＡ的剪切作用,使ＨＢｅＡｇ的表达量明显受到抑制。     

氧化苦参碱抗丙型肝炎病毒的体外实验研究

目的观察氧化苦参碱体外抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的活性。方法借助脂质体将重组ＨＣＶ基因（ｐＢＫ－ＨＣＶ）转染ＳＭＭＣ－７７２１细胞,并以此为模型,通过ｂＤＮＡ信号扩增法定量检测细胞内ＨＣＶ ＲＮＡ的变化,观察氧化苦参碱对ＨＣＶ ＲＮＡ的抑制作用; ＭＴＴ比色法观察药物的细胞毒性。结果建立了重组ＨＣＶ基因转染的稳定表达细胞模型,可作为药物研究的工具。氧化苦参碱浓度为１００— １０００μｇ／ｍｌ时能明显降低细胞内ＨＣＶＲＮＡ水平,有效浓度范围内无明显细胞毒性作用。结论氧化苦参碱能够在细胞水平有效地抑制ＨＣＶ ＲＮＡ,具有直接抗ＨＣＶ作用。     

重组丙型肝炎病毒基因转染H9细胞模型的建立

目的：建立重组ＨＣＶ基因转染的Ｈ９细胞（人ＣＤ４，Ｔ细胞）模型。方法：以载体ＣＤＺ２（连接有１６９３ｂｐＨＣＶＤＮＡ，包括完整的ＨＣＶ结构区）为模板，通过ＰＣＲ获得高保真的１．７３ｋｂＤＮＡ片段（包括１６９３ｂｐＨＣＶｃＤＮＡ和部分载体ＤＮＡ序列），其特异性被ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实。将ＨＣＶｃＤＮＡ片段插入载体ｐＣＤ－ＳＲα，经菌落原位杂交以及酶切分斤和ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｏＩｔ筛选，获得重组ＨＣＶ（ｐＣＤ－ＨＣＶ），并与ｐＳＶ２－ｇｐｔ载体共转染Ｈ９细胞。结果：从选择性培养基中筛选口阳性克隆细胞，经ＲＴ－ＰＣＲ．ｄｏｔＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证表明ｐＣＤ－ＨＣＶ在Ｈ９细胞中可进行复制、转录和表达，表达的约１．３×１０５大小蛋白具有ＨＣＶ抗原性。转染ｐＣＤ－ＨＣＶ的细胞培养至９０天时，仍可检测到ＨＣＶｍＲＮＡ和ＨＣＶ抗原。结论：建立ｐＣＤ－ＨＣＶ转染的Ｈ９细胞模型获得成功。     

抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较

研究针对ＨＣＶ 5′ＮＣＲ2 13位点和Ｃ区 4 98位点的核酶细胞内对ＨＣＶ基因表达的抑制作用。应用ＷＩＳＨ ｎｃ转基因细胞模型 ,通过脂质体法转染核酶表达载体 ,经发光检测仪测定荧光素酶报告基因的表达变化。结果表明 ,核酶 2 13和核酶 4 98均能在细胞内降低荧光素酶的表达 ,转染后 7ｄ内的抑制率为 4 2 .94 %～ 67.81% ,但两者比较无显著性差异。构建的两个核酶表达载体均能在ＷＩＳＨ ｎｃ细胞内有效地抑制ＨＣＶ基因的表达。抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较@贾战生!710038$西安第四军医大学唐都医院感染科 @焦成松!710038$西…     

庚型肝炎病毒感染的临床流行情况和致病力的探讨

目的：为了弄清肝病患者中庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的临床感染情况和评估庚型肝炎病毒的致病力。方法：本文调查了２１３例肝病患者的ＨＧＶ感染情况和分析了ＨＧＶ感染的致病力。结果：在２１３例肝病患者中，ＨＧＶ的感染率为７５％（１６／２１３）；其中，ＨＧＶ与ＨＢＶ、ＨＣＶ以及ＨＢＶ和ＨＣＶ的合并感染分别是为７１％（９／１２７）、１８２％（２／１１）和２７８％（５／１８）。未发现ＨＢＶ合并ＨＧＶ感染和单独ＨＢＶ感染两组之间肝功能的损害程度存在差异。结论：以上结果提示，ＨＧＶ通常与胃肠外传播的ＨＢＶ和ＨＣＶ合并感染。而且，ＨＧＶ的致病力看来是温和的     

病毒胸苷激酶基因治疗人胃癌的实验研究

为观察单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用，将ＨＳＶ－ＴＫｃＤＮＡ定向克隆入逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，用ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ法将该ＨＳＶ－ＴＫ基因转染胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１，测定阳性转染细胞（ＳＧＣ－７９０１／ＴＫ）在体内外对ＧＣＶ的敏感性。结果示ＧＣＶ在体外对ＳＧＣ－７９０１／ＴＫ细胞有明显的杀伤作用，其作用呈现剂量和时间依赖性特点，且同时表现出对周围亲代ＳＧＣ－７９０１细胞的杀伤效应（旁观者效应）。体内实验表明ＧＣＶ可抑制ＨＳＶ－ＴＫ阳性胃癌细胞的生长，使已形成的肿瘤逐渐消失。提示逆转录病毒载体介导的ＨＳＶ－ＴＫ基因转移胃癌细胞，配合以ＧＣＶ治疗，是胃癌基因治疗的又一途径。     

丙型肝炎病毒NS_5B在Hub-7细胞中的转染与表达

目的建立丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５Ｂ表达的人肝细胞系。方法以脂质体共转染ＮＳ５ＳＢ基因人Ｈｕｂ－７细胞,以ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ在ＤＮＡ水平检测转染的结果,以ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实了Ｈｕｂ－７细胞中有ＮＳｕＢ的蛋白表达。结累在转染过ＮＳＳＢ质粒的细胞系中有ＮＳＳＢ基因的存在和ＨＣＶ－ＲＮＡ多聚酶的表达。结论我们在Ｈｕｂ－７细胞中建立了ＨＣＶ－ＲＮＡ多聚酶表达系统,它有助于研究ＨＣＶ复制机制和为基因治疗丙型肝炎打下基础。     

抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计

目的设计可位点特异切割丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’非编码区（５’ＮＣＲ）和Ｃ区的多位点核酶（ＲＺ）．方法根据“锤头结构”ＲＺ的设计原理，以ＨＣＶＨ（１ａ）株５’ＮＣＲ和Ｃ区ＲＮＡ为靶序列，计算机预测其二级结构，运用能量最低化程序，选择理论上理想的ＲＺ切割位点，并比较５株ＨＣＶ序列ＲＺ切点两翼的同性．结果在ＨＣＶ５’ＮＣＲ和Ｃ区１２４个自然切割位点（ＣＵＸ和ＧＵＸ）中选出２１３（ＣＵＣ），２６０（ＧＵＡ），４０７（ＧＵＣ）和４９８（ＣＵＵ）４个切割位点，不同株之间切点两翼ＲＺ结合序列同源性为１００％．结论计算机可作为抗病毒ＲＺ设计的辅助工具；ＨＣＶ上述４个位点可能是最理想的切割位点．     

双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究

目的 观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶在细胞内阻断Ｃ区基因表达的作用。方法 采用垩 克隆技术，从ｐＧＥＭ－核酶１２３（含针对ＨＢＶＣ区２０２９－２０３１及２０６３－２０６５双位点核酶）上切下双位点核酶的片段，定向克隆于真核表达载体ｐＢＢＳ２１２中，利用脂质体介导，将重组质粒ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ与Ｐ１，２Ⅱ（含乙型肝炎病毒全序列）花园要入人肝癌细胞（ＨＨＣＣ）中，采用原位杂交观察核酶的表达，ＥＬＩＡＳＡ     

慢性乙型肝炎和肝硬化中乙型肝炎病毒X抗原表达的分析

用基因工程技术由大肠杆菌合成重组乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ抗原（ＨＢｘＡｇ）并制备兔抗－ＨＢｘＩｇＧ以检测ＨＢｘＡｇ，合成一对以ＨＢＶＸ基因序列为模板的引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增ＨＢＶＤＮＡ。免疫组织化学和血清学方法分别用以分析肝病患者肝组织中的ＨＢｘＡｇ和血清标本中的ＨＢｘＡｇ、抗－ＨＢｘ。发现ＨＢｘＡｇ在慢性活动性肝炎（ＣＡＨ）患者肝组织中检出率为７２．７％，在肝炎后肝硬化（ＬＣ）中为９２．６％，而乙型肝炎核心抗原（ＨＢｃＡｇ）在ＬＣ中检出率为４７．８％。在ＣＡＨ、慢性迁延性肝炎和ＬＣ的血清中ＨＢｘＡｇ的阳性率分别为４４．４％、６６．６％和３３．３％，与ＨＢｅＡｇ的阳性率相似，而且在这些ＨＢｘＡｇ阳性的血清中可检出ＨＢＶＤＮＡ的存在，ＨＢｘＡｇ的表达与ＨＢＶ复制紧密相关，ＨＢｘＡｇ可能是一慢性ＨＢＶ感染的重要标志物。     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒联合基因免疫实验研究

为ＨＣＶ/ＨＢＶ重叠或混合感染的防治寻求新的高效联合基因免疫策略 ,分别将与ＨＣＶ核心区基因互补的ｃＤＮＡ和ＨＢＶ核心区基因克隆于具有两套独立表达单元的真核表达载体 ｐＲＳＣ的巨细胞病毒启动子和ＲＳＶ启动子下游 ,称为ｐＲＳＣ ＨＢＶ/ＨＣＶ ,转染ＳＰ2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法观测蛋白的表达 ,免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠 ;用酶联免疫法、ＭＴＴ法及荷瘤试验观察小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答。结果表明 ,ｐＲＳＣ ＨＢＶ/ＨＣＶ转染ＳＰ2 / 0细胞可见ＨＢｃＡｇ及ＨＣＶ核蛋白染色阳性荧光细胞 ,相对分子质…     

上海市、江苏省丙型肝炎病毒NS_3区C_（33c）抗原基因cDNA的克隆及序列

本文作者旨在运用分子克隆技术阐明上海市及江苏省丙型肝炎患者血清中两株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ３３ｃ抗原基因的序列及变异特征，为临床检测提供理论依据，并为进一步表达Ｃ３３ｃ抗原作好准备。结果表明：上海株及江苏株Ｃ３３ｃ抗原基因同源性大于９９％，推测属同一基因型。此两株与其它分离株相比较，氨基酸水平的同源性（９３．０８％～９７．６９％）明显高于核苷酸水平的同源性（８１．３６％～９４．４５％），说明Ｃ３３ｃ抗原特别适于作诊断抗原。     

丙型肝炎病毒NS5b区与5'-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５ｂ区与５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）不同基因区ＲＮＡ检测结果的区别及临床应用价值。利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测１４８例肝炎患者血清ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因的ｃＤＮＡ,并与５’－ＮＣＲ基因区ｃＤＮＡ检测技术进行了比较。结果 ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因区ＲＮＡ检出率为２４．３％（３４／１４８）,５’－ＮＣＲ基因区ＲＮＡ检出率为３１．１％（４７／１４８）。Ｈ     

丁型肝炎病毒体外短期细胞培养系统的建立

为建立ＨＤＶ的体外细胞培养系统，采用体外细胞转染技术，用含基因ＨＤＶｃＤＮＡ三聚体的重组质粒ｐＳＶＬＤ３转染ＨＢＶ的体外细胞培养株（２．２．１５细胞株）。结果在转染后３天的转染细胞内和培养上清中检出了１．７ＫｂＨＤＶＲＮＡ和２４０００、２７０００ＨＤＡｇ。初步结果提示，该转染细胞培养上清中有ＨＤＶ病毒的排泌，从而建立了ＨＤＶ的体外短期培养系统。