金黄色葡萄球菌荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型的建立及评价

目的建立金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型,并对模型进行免疫攻毒保护性评价。方法金葡菌荚膜多糖型CP8国际标准株49525经37℃培养24 h,用PBS缓冲液稀释成不同浓度菌液,分组经腹腔注射感染BALB/c小鼠,观察小鼠发病症状,统计生存率及体重变化,确定每只小鼠的致死剂量及亚致死剂量;采集不同感染时间的小鼠血液及心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏,进行细菌定植量检测及主要脏器病理学检查。用CP8多糖-蛋白偶联物(实验组)及氢氧化铝佐剂(对照组)对建立的小鼠模型进行3次免疫攻毒保护性实验,统计小鼠存活率。结果经腹腔感染途径建立的小鼠模型,每只致死剂量为3. 0×10~9 CFU,亚致死剂量为1. 5×10~9CFU。感染发病小鼠表现为翘毛弓背、耸肩及行动迟缓,生存率及体重随感染剂量增加明显下降,血液及心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏均有细菌定植,心脏、肾脏、肝脏主要脏器中可见明显细胞坏死和炎性细胞浸润。与对照组比较,实验组小鼠3次攻毒存活率差异均有统计学意义(P均0. 01),对小鼠的保护率分别为55. 6%、50. 0%和57. 1%。结论成功建立金葡菌荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型,并可用于疫苗保护性评价,为进一步研究多抗原组分疫苗的有效性和安全性奠定了实验基础。     

11型鸭疫里默菌的生物学特性

目的分析11型鸭疫里默菌(Riemerella anatipestifer,RA)的药物敏感性、致病性及其免疫保护力。方法纸片扩散法检测73株11型RA分离株的药物敏感性;将2×108和2×107CFU/ml的RA菌株悬浮液分别经皮下注射10羽10日龄的樱桃谷鸭,0.5 ml/羽,攻菌后连续观察5 d,记录死亡数,并从死亡鸭肝脏中分离细菌,计算死亡率;用分离的菌株RA1229制备灭活油乳剂疫苗,分别经皮下注射50羽7日龄樱桃谷鸭,0.3 ml/羽,14 d后,各组樱桃谷鸭均经皮下注射RAf74、RA234、RA1067、RA1156和RA1229的新鲜培养液(含菌量为2×107CFU/ml),0.5 ml/羽,攻菌后连续观察5 d,记录死亡数,并从死亡鸭肝脏中分离细菌,计算死亡率。结果 90%以上菌株敏感的药物有头孢唑啉、氟苯尼考和头孢氨苄,其他敏感药物依次为阿莫西林、氨苄西林、强力霉素、壮观霉素、丁胺卡那霉素和利福平;死亡鸭肝脏分离株中有10株的致病性相似,注射1×108及1×107CFU/ml RA的樱桃谷鸭死亡率分别为100%及80%,RA1229的致病性略强;RA1229制备的疫苗对樱桃谷鸭的保护率高于90%。结论 11型RA对多种抗生素敏感,有较强的致病性,RA1229具有良好的免疫保护力,可作为制备RA灭活疫苗的候选菌株。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC_007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580 000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440 000)为主。试验组小鼠对49521 3次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。     

铁载体受体蛋白IroN的原核表达及其对肠道外致病性大肠杆菌感染小鼠的免疫保护作用

目的原核表达重组铁载体受体蛋白IroN,并探讨其对小鼠肠道外致病性大肠杆菌群(Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)感染的免疫保护作用。方法从E.coliJ96基因组DNA中扩增IroN基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a-IroN,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组IroN蛋白纯化后,经皮下免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和尿液中的抗体水平;以E.coliJ96菌株分别经腹腔和尿道途径攻击免疫小鼠,计算保护率并计数细菌数。结果重组IroN蛋白的表达量为32%,纯化后纯度超过85%,且具有良好的反应原性。重组IroN蛋白经皮下免疫小鼠,可诱导小鼠血清产生高水平的特异性IgG抗体,在尿液中未检测到特异性IgA抗体。重组IroN蛋白对腹腔攻击ExPEC感染小鼠的保护率为81.8%(P<0.05);重组IroN蛋白免疫的小鼠经尿道攻击ExPEC后,肾脏分离的菌落数比对照组(PBS免疫)降低了100倍以上(P<0.05),但膀胱和尿液中的菌落数两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论已原核表达并纯化了IroN蛋白,其对ExPEC感染小鼠的腹腔和肾脏具有显著的保护作用,但对膀胱感染无保护作用。     

鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)的致病性

目的评价鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)的致病性。方法采用鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspi C[1×10~7、1×10~9 CFU/(0. 1 mL·只)]及鸡白痢沙门菌S06004(Nal~R)[1×10~7 CFU/(0. 1 mL·只)],分别经肌肉注射和口服感染小鼠,同时设空白对照组(未感染)。观察小鼠的临床症状、病理、体重、脏器内菌体载量、粪便排菌及脾脏细胞因子水平,分析鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株对小鼠的致病性。结果与空白对照组比较,各组小鼠均未出现任何临床症状,肝脏、脾脏、盲肠病理观察均未见任何病变,体重变化差异无统计学意义(P 0. 05)。与鸡白痢沙门菌S06004(Nal R)感染组比较,减毒活疫苗候选株感染组小鼠肝脏、脾脏、盲肠内及小鼠粪便载菌量均降低。各感染组小鼠脾脏中炎性因子IL-1β、IFNγ、IL-12、IL-6表达量均较低,仅引起小鼠轻微短暂的炎症反应。结论鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)无致病性,符合公共卫生安全要求。     

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用。方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价。结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少。结论PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用。     

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。     

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备及免疫试验

目的利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)安徽分离株制备油乳剂灭活疫苗,并进行免疫试验。方法PRRSV经Marc-145细胞传代增殖,制备油乳剂灭活疫苗;物理性状、无菌试验及安全性试验合格后,经肌肉注射免疫健康仔猪,并进行攻毒;分别检测免疫仔猪的血清抗体水平及保护力,并进行免疫程序及与市售疫苗的免疫效果的比较试验。结果制备的灭活疫苗的适宜免疫剂量为2ml/头,免疫后14d血清抗体水平可达高峰;使用同一病毒攻毒,保护率为80%(4/5)。采用灭活疫苗2次免疫及灭活疫苗与弱毒疫苗交替2次免疫,免疫效果均较好。制备的灭活疫苗免疫效果与1号市售灭活疫苗相比,差异无统计学意义,且优于2号市售灭活疫苗。结论已成功制备了PRRSV安徽分离株油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全可靠,免疫效果好,适于推广使用。     

布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠的免疫学评价

目的评价布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠后黏膜、体液及细胞免疫的效果。方法将60只小鼠随机分为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(3×108个/只)和阴性对照组(生理盐水),均于小鼠清醒状态下进行滴鼻免疫布氏菌活疫苗,剂量为10μl/只(5μl/鼻孔)。免疫30 d后,分离血清,制备脾脏淋巴细胞及肺泡灌洗液。间接ELISA法检测免疫小鼠血清中Ig G抗体效价、肺泡灌洗液中Ig G、Ig A抗体效价及体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ、IL-4水平;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目;流式细胞术检测T细胞亚群分类。用羊布氏菌弱毒株M5经皮下和滴鼻两种途径攻击免疫小鼠,通过脾脏细菌计数评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低剂量组和高剂量组小鼠血清中Ig G抗体效价及小鼠肺泡灌洗液中的Ig G、Ig A差异无统计学意义(P0.05);低剂量组和高剂量组小鼠在Br-PPD抗原和灭活菌体抗原刺激下,分泌IFNγ的脾脏淋巴细胞数、体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ的水平及脾淋巴细胞中CD4~+IFNγ~+细胞比例均明显高于阴性对照组(P0.05);攻毒试验结果表明,布氏菌活疫苗具有良好的保护力。结论布氏菌活疫苗经滴鼻免疫小鼠后可获得良好的免疫效果和保护力。     

猪丹毒丝菌-猪链球菌二联油乳剂灭活疫苗的制备及其免疫效果评价

目的 制备猪丹毒丝菌(E. rhusiopathiae,ER)-猪链球菌(Streptococcus suis,SS)二联油乳剂灭活疫苗,并评价其免疫效果。方法 以1株1a型ER(编号AEr31)和1株2型SS(SS2,编号HF2)为制苗菌株,甲醛为灭活剂,ISA 201VG矿物油为佐剂,通过两种方式将灭活全菌体(V-AEr31,V-HF2)与佐剂混合[(V-AEr31+V-HF2)+ISA 201VG及(V-AEr31+ISA 201VG)+(V-HF2+ISA 201VG)],制备ER-SS2二联油乳剂灭活疫苗,进行性状、无菌和安全检验。将两种灭活疫苗分别经皮下多点注射免疫小鼠(Ⅰ和Ⅱ组),同时设0.9%氯化钠对照组(Ⅲ组)。间接ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价和相关细胞因子(IL-4、IL-10、IFNγ、TNF-β、MCP-1)含量,血清杀菌试验检测功能性抗体水平,MTT法测定脾淋巴细胞增殖指数(SI),流式细胞术测定CD4⁺与CD8⁺外周血T淋巴细胞亚群百分比;腹腔攻毒试验测定免疫保护率,组织荷菌数法测定攻毒菌株在体内的定植...     

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性

目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。     

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究

目的 研究百日咳毒素S1(Pertussis toxin s1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性。方法 采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOPO10。用抗S1的单抗1B7检测表达产物。用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验。rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性。并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验。结果 rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14％(DH5α)和24.2％(TOPO10)。rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3％。家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000。抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100％。结论 rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫性

目的　研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法　用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果　小鼠免疫 1针后均能抵抗国内 11株和国外 11株乙脑病毒的攻击 ,保护率均可达 90 %以上 ;人体免疫血清对台湾 1株和国外 9株病毒均有明显的中和作用。结论　SA14 142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1和5型交叉免疫保护研究

目的探讨猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)不同血清型间交叉免疫保护的关系。方法以1型和5型APP参考菌株为实验对象,分别测定半数致死量(LD50),制备灭活细菌抗原和活菌抗原,免疫昆明小鼠,检测ELISA抗体水平及交叉免疫反应,并分别以10LD501型和5型APP菌进行攻击,观察小鼠保护力。结果1型和5型APP菌对小鼠的半数致死量分别为8.0×105.3和5.1×103.83CFU/LD50,死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均可产生高滴度抗体,且1型与5型间存在较强的交叉免疫反应。死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均能对本型APP菌攻击产生保护,保护率在80%以上。1型活菌免疫小鼠对5型菌攻击保护率为70%,5型活菌免疫小鼠对1型菌攻击保护率为90%,1型、5型死菌免疫小鼠对5型、1型菌交叉攻击均无保护作用。结论1型、5型APP活菌和死菌免疫小鼠均可对本型菌攻击产生保护,两型间存在较强的交叉免疫反应,但只有活菌免疫可以产生较好的交叉免疫保护,死菌免疫不能产生交叉免疫保护。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。     

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。