QPCR法与DNA探针杂交法检测重组人生长激素原液中残余DNA的比较

目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)原液中残余DNA检测的实时荧光定量PCR(以下简称QPCR)法和DNA探针杂交法进行对比。方法提取3批rhGH原液中残余DNA,经SYBR GREENⅠ荧光染料法对残余DNA进行QPCR检测,对建立的方法进行准确度、精密度及引物特异性验证,并与《中国药典》三部(2015版)中规定的DNA探针杂交法检测的残余DNA含量进行比较。结果 QPCR法对3批rhGH原液残余DNA含量均可定量,灵敏度可达7. 5 fg。标准品DNA浓度在7. 5 fg/μL～750 pg/μL范围内线性关系良好,R2为0. 998,加标回收率为78. 40%～106. 45%。两种方法检测的3批rhGH原液残余DNA含量均小于《中国药典》三部(2015版)中规定的10 ng/剂量的要求。结论 QPCR法高效快捷,通过DNA与染料结合可实时监控PCR过程中的每一步反应,减小污染,对样品中残余DNA可进行准确定量,比DNA探针杂交法更适用于样品中残余DNA含量的检测。     

冻干甲型肝炎减毒活疫苗的接种反应及免疫原性观察

目的观察冻干甲型肝炎减毒活疫苗的接种反应和免疫原性。方法采用随机、开放式试验设计,选择出生后未接种过甲肝疫苗的18月龄以上的儿童和18～35周岁的成人,接种冻干甲肝减毒活疫苗1针。接种后30min观察即时反应,24、48和72h进行局部和全身反应观察,免后30d采血,分离血清,进行免疫原性检测。结果562名观察对象接种疫苗后均未发生局部反应,全身反应仅表现为轻度发热,有35人次(6.23%)发生发热反应。471名完成免疫原性检测的观察对象免后抗-HAV阳性率为99.8%,保护性抗体阳性率为96.4%,抗-HAVGMC水平为527.4mIU/ml,较免前增长30.3倍。儿童组和成人组免后保护性抗体阳性率分别为97.0%和95.9%,抗-HAVGMC水平分别为84.1和2119.1mIU/ml。2组免前免后抗体阳性率和GMC水平差异均有统计学意义。277名易感者免后抗体阳性率为99.6%,保护性抗体阳性率为93.9%,GMC水平为92.6mIU/ml,儿童组免后抗体阳性率明显高于成人组,免后抗-HAVGMC水平则明显低于成人组,2组之间免后抗体阳性率和GMC水平差异均有统计学意义。结论国产冻干甲型肝炎减毒活疫苗接种后副反应轻微,免疫原性良好,适于推广应用。     

应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究

目的 以构建的pET28a为表达载体,探讨人 IFN-α2b基因在pET系统中的表达。方法 合成引物,通过PCR扩增人 IFN-α2b基因并引入点突变,在不改变天然 IFN-α2b氨基酸序列的前提下,使原 IFN-α2b基因4个大肠杆菌稀有密码子改变为偏爱密码子,在起始密码子后,编码前16个氨基酸的碱基序列均成为大肠杆菌的偏爱密码子。将PCR产物次级克隆人pET28a载体,构建重组表达载pET28a-IFN-α2b。筛选正确的重组表达质粒pET28a-IFN-α2b转入感受态表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,粗提并检测 IFN-α2b活性。结果 重组质粒pET28a-IFN-α2b在宿主菌 BL21(DE3)中表达出的rhIFN-α2b以可溶性蛋白形式存在于粗提上清液中,与原来 pBV889系统表达的干扰素相比,具有更高的生物学活性。结论 应用pET表达系统可表达出具有更高生物学活性的rhIFN-α2b蛋白。     

长春地区冬季婴幼儿腹泻轮状病毒的流行趋势

对长春地区1987年冬季113份急性腹泻住院患儿粪便标本进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析,有33份呈现典型的 A 组轮状病毒的核酸电泳图谱,检出率为29.3%。在33份阳性标本中,有32份为电泳长型(97%),1份为电泳短型;对1988年冬季57份标本分析,有17份呈现典型的 A 组轮状病毒图谱,检出率为29.8%。在17份阳性标本中,有13份为电泳长型(76.5%),4份为电泳短型;对1989年冬季45份标本分析,有25份呈现典型的 A 组轮状病毒图谱,检出率为55.6%。在25份阳性标本中,有18份为电泳长型(72.0%),7份为电泳短型。以上结果证实,在1987～1989年冬季长春地区轮状病毒流行的优势亚群均为电泳长型。根据电泳长型图谱中2、3和7、8片段迁移排列方式的微小差异,可以确定2～3种不同电泳图谱的存在。流行优势株的电泳图谱在3年中交替变化。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。     

胸腺五肽固相合成及免疫增强作用的研究

目的　合成有生物活性的胸腺五肽并研究其免疫增强作用。方法　用Fmoc固相肽合成法合成胸腺五肽 ,用E玫瑰花实验检测生物活性。合成的胸腺五肽经小鼠腹腔注射后进行淋巴细胞转化实验、溶血空斑实验及IL 2活性实验 ,研究其免疫增强作用。结果　合成 2批胸腺五肽 ,精肽产量分别为 2 7mg和 3 4mg ,具有生物活性 ,实验组动物脾淋巴细胞的转化率、空斑形成细胞及IL 2活性皆明显高于空白对照组。结论　用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的胸腺五肽 ,且具有免疫增强作用。     

柯萨奇病毒A组6型衣壳蛋白VP1的原核表达及其抗血清的制备

目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清。方法合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,同时优化IPTG终浓度(0. 1、0. 2、0. 3、0. 5 mmol/L)、诱导温度(15、20、25、30℃)及诱导时间(6、8、12、16 h)。表达产物采用Ni-NTA柱亲和层析纯化,将纯化重组蛋白免疫新西兰兔,制备VP1抗血清,微量细胞病变法检测血清抗体效价。结果重组质粒p ET-28a-VP1经双酶切及测序鉴定,构建正确。重组蛋白最适诱导条件为:IPTG终浓度为0. 3 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为12 h。重组蛋白相对分子质量约34 000,于上清和包涵体中均有表达,纯化后纯度可达95%以上。兔血清效价均> 1∶8,呈阳性。结论成功于原核表达系统中高效表达了可溶性CVA6-VP1蛋白,且获得效价较高的抗血清。