福州地区113株淋球菌的质粒和耐药性

对福州地区分离的113株奈瑟氏淋球菌进行了质粒和耐药性的研究,发现86. 7％菌株携带2.6Md隐蔽性质粒,并检见含4.5Md耐药性质粒26株和24.5Md传递性质粒24株。所分离的淋菌69.9％出现耐药现象,其中耐3种以上抗生素占38.1％。对菌株的青霉素耐药现象和耐药性质粒的关系进行了讨论。     

单纯疱疹病毒DNA探针制备的研究

应用“Hirt上清法”直接从感染细胞中提取HSV-1(Sm44)标准株DNA,经BamHI酶切获得DNA片段混合物制备探针。实验结果表明,该探针可与HSV-1 (SM44)、HSV-2(SAV)标准株和HSV-1分离株以及重组质粒的DNA杂交,而不与ADV(8型)、CMV及人肺炎支原体和pBR322质粒的DNA提取物杂交,显示此DNA探针的特异性。为将HSV DNA探针用于临床标本检测建立了初步的实验基础。     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

聚合酶链反应结合DNA探针杂交在结核杆菌检测中的应用

应用PCR和Southern转移、光敏生物素标记DNA探针杂交技术进行了结核杆菌检测的应用研究。实验结果表明PCR结合探针杂交可将PCR敏感性提高100倍,但不影响其特异性。106例结核性痰标本PCR检测阳性率为46.2％,结合探针杂交达76.4％,涂片阴性的标本差异尤为明显,因而显著提高了结核阳性诊断变率。21例非结核性痰标本PCR和探针杂交未发现假阳性。对临床可疑而PCR阴性标本有必要合用DNA探针杂交。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

间日疟原虫DNA重组克隆的酶切鉴定和DNA转印杂交分析

我们已从间日疟原虫DNA文库中筛选出间日疟原虫特异性DNA片段的克隆,作者用限制性核酸内切酶消化和DNA转印杂交等基因工程手段,对重组质粒作进一步鉴定和分析,以期了解重组克隆的特征和性质,为检测疟原虫的探针提供实验数据和材料背景。     

pCR~(TM)-FGFR1E重组质粒变异的初步分析

目的 :在实验中发现携带人成纤维生长因子受体 1细胞外段 (FGFR1E) c DNA的 p CRTM 质粒大小发生改变 ,由原来的 4 70 0 bp变为 90 0 0 bp,对之进行深入研究。方法 :采用限制性内切酶消化及Southern杂交分析。结果 :变异质粒的 Sa1l 、Xba 、Bam H 等多个酶切片段与原质粒不同 ,但与FGFR1c DNA探针杂交信号阳性。结论 :变异质粒多个酶切位点变化 ,且该质粒包含 FGFR1E同源序列     

非放射性马来丝虫DNA探针pBm15-F-Dig的制备及其用于微丝蚴检测的研究

近年来DNA探针技术尤其是非放射性标记技术的发展,为提供高效实用的丝虫病病原监测手段开辟了新的途径。本研究以非放射性标记方法制备马来丝虫DNA探针,并进行微丝蚴DNA和病人血中微丝蚴的杂交试验检测。含有马来丝虫种特异性DNA片段的重组质粒pBm15系美国哈佛大学公共卫生学院Piessens博士惠赠。以氯化钙法制备大肠杆菌JM101感受态细胞,用该重组质粒     

DNA芯片快速检测淋球菌16SrRNA基因突变

目的探讨新研制的DNA芯片应用于快速检测淋球菌16S rRNA基因突变的临床应用价值。方法根据淋球菌16SrRNA基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含16S rRNA基因突变的目的 DNA片段,与芯片杂交,同时以测序法为对照。结果 87份泌尿生殖道拭子均可被DNA芯片检测,同时检测发现有1株淋球菌16S rRNA基因突变(2709 C→T),与测序结果一致。结论DNA芯片检测淋球菌16SrRNA基因突变具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于对大观霉素的耐药性临床检测。     

用生物素标记CVB_3 cDNA制备探针检测病毒核酸

本文报道用含CVB_3 cDNA PstI酶切片段(530bp)的重组质粒pGP_(51)B转化大肠菌;经扩增后提取,纯化重组质粒DNA;用生物素标记制备探针。通过原位杂交技术检测不同的肠道病毒和非肠道病毒感染的HeLa细胞。实验结果表明,该探针只与肠道病毒RNA杂交,而不与非肠道病毒核酸杂交,且可检测出病毒感染后3h,5h(CPE-)的病毒核酸。可见该探针具有良好的特异性和敏感性,且可用于肠道病毒感染引起的心脏疾病的活检标本诊断。     

牛雄性DNA特异的限制性片段研究

牛基因组DNA经PstI酶解后,以与性别有关的雌性蛇的小卫星DNA组份一BKm序列(p184)为探针进行分子杂交,回收4.4kb牛雄性DNA片段,以pUC_(19)为载体亚克隆,重组质粒经菌落原位杂交和Southern blot分子杂交鉴定。将此雄性DNA片段检测牛基因组DNA,观察到由于性别的不同而出现不一样的杂交模式。实验结果表明,用来自牛雄性DNA特异的限制性片段的重组质粒作探针,Southern blot分子杂交方法可以鉴定牛的性别。     

基因探针在大肠杆菌中的扩增及其提纯

本文报道了基因探针在大肠杆菌中的扩增与提纯方法。含基因探针的质粒用氯化钙方法转染大肠杆菌,被转染的细菌与质粒在培养液中同步扩增,然后用碱裂解法抽提扩增后的质粒。结果表明:(1)质粒的转化效率与其浓度有关;(2)经转染、扩增与抽提后,获得了大量的纯化质粒DNA;(3)纯化后的基因探针能满意地用于DNA 标记及分子杂交。     

淋球菌的质粒谱与耐药谱分析

淋病是我国性传播疾病(STD)的主要病种，越来越引起人们的广泛关注，淋球菌是淋病的病原菌。淋病治疗过程中抗生素的滥用以及用药的不规范，产生了新耐药菌株和新的耐药谱，给临床治疗用药带来了困难。为了解我区淋球菌的耐药情况以及耐药与质粒的关系，我们于2002年从深圳市龙岗区各医院STD门诊病人中分离到40株淋球菌，并对其质粒谱与耐药谱进行了研究。现报道如下。     

生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针的制备

通过大量培养克隆有 HPV11、16、18、51型 DNA 序列的菌株,扩增其质粒,并采用碱变性法提取、纯化质粒 DNA,然后对质粒进行酶切、电泳回收 HPV DNA 片段并进行生物素标记,制备出生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针.用斑点杂交方法检测探针的灵敏度为 HPV11、16型0.05pg,HPV18 0.25 pg,HPV51 0.1 pg.     

产黑色素普氏菌DNA探针用于口腔颌面部脓液标本检测的初探

目的：评价产黑色素普氏菌（ATCC25845）DNA探针的准确性。方法：采用产黑色素普氏菌DNA探针直接对26例口腔颌面部的脓液标本杂交,放射自显影照片确定杂交率,并与传统方法加以对照。结果：深外法与传统法的结果一致。结论：产黑色素普氏菌可用于临床脓液标本的直接检测。     

原位杂交技术在培养细胞冰冻切片和石蜡片切中的应用

本实验详细地探讨了原位杂交技术的有关问题:生物素标记DNA探针的制备,各类来源标本的制备,杂交前、中、后细胞组织切片的处理等;并把缺口翻译法合成的生物素化EB病毒DNA探针应用于检测培养细胞,冰冻和石蜡切片中EB病毒Bam HI-W重复片断DNA序列。实验结果表明:自制的EB病毒DNA探针完全可靠;所采用的一套原位杂交技术适用于检测上述三类不同的标本,其检测的结果是满意的。     

应用聚合酶链反应检测淋病奈瑟氏菌

根据已知淋球菌隐蔽性质粒的ｃｐｐＢ基因序列，设计了一对聚合酶链反应引物，对２１株淋球菌进行扩增均获得３９０ｂｐ片段，６株其它奈瑟氏菌及９株共生菌未能扩增出任何片段。该３９０ｂｐ片段能被限制性内切酶ＭｓｐＩ降解为２５０ｂｐ，１４０ｂｐ两个片段。经过３５个ＰＣＲ循环可检测出４００ｃｆｕ淋球菌。用ＰＣＲ法检测８２份临床标本，其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为：１００％，９０％，９１．３％及１００％。     

淋球菌隐蔽性质粒cppB基因探针=制备及初步应用的研究

应用碱变性法从淋球菌Ｄ参考菌株获得４．２ｋｂ隐蔽性质粒ＤＮＡ，通过ＰＣＲ方法扩增该质粒６２３ｂｐｃｐｐＢ基因，采用ＤＮＡ直接酶标－化学发光自显影技术标记ｃｐｐＢ基因探针，通过斑点及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交加以鉴定并初步应用于临床标本检测。旨在为临床淋病实验室诊断提供一个简便，快速方法。     

牛Y染色体DNA富集文库的构建

作者根据DNA复性动力学原理,使牛雄性基因组DNA经Sau3A完全消化,雌性DNA被剪切到分子量平均500bp大小,二者混合重聚反应后,以pUC_(19)为载体,JM109为宿主菌,构建了Y染色体DNA富集文库。分别以雄性和雌性基因组DNA作探针进行菌落原位杂交,结果表明,1000个克隆中约有6个克隆对雄性DNA探针产生强的杂交信号。PvuⅡ酶切重组质粒,大多数质粒有短片段插入,分子量在90～300bp之间。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。