氮缺乏对保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达的影响

试验选取保加利亚乳杆菌作为研究对象,探讨氮缺乏对保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键蛋白酶基因表达的影响。试验采用qRT-PCR技术分析7株保加利亚乳杆菌中pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT胞内关键肽酶基因在氮缺乏培养条件下的基因表达情况。研究结果表明,氮缺乏培养条件下,pepF基因表达量比MRS液体培养条件下显著上调(P0.05),平均上调3.2倍,而pepX和pepC基因表达水平呈显著下调趋势(P0.05);氮缺乏培养条件下,菌株LB08006、LB08007和LB08015中pepT和pepQ基因表达量上调,而在菌株LB08012、L08014、LB08016和LB08017中pepT和pepQ基因表达量则是下调的。可见,氮缺乏显著影响保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达,且在不同菌株间表现出不同的表达量。     

不同生长阶段保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达变化规律

乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白质,必须通过蛋白水解体系水解外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。该研究选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208)进行脱脂乳发酵,在mRNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌体不同生长阶段表达的动态变化。结果表明,所有菌株生长曲线均呈S型。随着菌体在脱脂乳中的不断生长,蛋白水解活力极显著增强(P<0.01),7个目的基因相对表达量呈现总体上调。6株菌的prtB和oppD基因在对数期的相对表达量极显著高于对照组(4h)(P<0.01)。对数期的胞内肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表达量与对照组(4 h)相比,呈极显著上调(P<0.01),但菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在对数期下调,而稳定期上调。由此可见,蛋白水解活力较高的菌株,其生长和产酸特性也较高;发现在脱脂乳中培养保加利亚乳杆菌,其关键蛋白酶基因的表达量呈时间依赖性,且菌株间各蛋白酶基因表达量有较大差异。     

不同初始pH值对保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达的影响

由于保加利亚乳杆菌自身不能直接利用外源蛋白,其必须通过蛋白水解体系外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。选择具有高蛋白水解活力的6株保加利亚乳杆菌作为供试菌种。将菌株接种于不同初始pH值的灭菌脱脂乳中,在m RNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因表达情况。结果表明:在脱脂乳体系中,初始pH值对保加利亚乳杆菌蛋白水解关键酶基因的表达存在显著影响,随着初始pH值的升高菌株KLDS 1.0501,1.9201,1.9203和1.0208的各基因表达量均上调,在pH=6.5时,部分基因表达量继续上调,且各菌株间蛋白基因表达有较大差异。     

弱后酸化保加利亚乳杆菌KLDS1.1011的筛选及其全基因组注释研究

为了研究影响保加利亚乳杆菌后酸化的关键基因,为酸奶发酵剂的开发提供分子水平的理论基础。本实验以实验室现有的8株保加利亚乳杆菌作为出发菌株,通过对其生长性能以及对酸敏感性筛选出KLDS1.0207、KLDS1.0205、KLDS1.1001、KLDS1.1011产酸差异性明显的4株保加利亚乳杆菌,通过对4株保加利亚乳杆菌单菌株发酵乳的凝乳时间、滴定酸度、乳糖消耗进行检测,分析得到菌株KLDS1.1011后酸化能力最弱。通过Illumina HiSeq与Illumina MiSeq测序平台对菌株菌株KLDS1.1011进行基因组测序,得到KLDS1.1011基因组全长1887491 bp,平均G+C含量为39.83%,基因组中共预测出2098个CDS,其总长度为1622760 bp,编码区域总长度占全基因组比例85.97%,编码基因的平均长度为773 bp;利用同源聚类分析方式比较保加利亚乳杆菌KLDS1.1011和KLDS1.0207基因组,发现两者有1631个共有基因,KLDS1.1011有353个特有基因,KLDS1.0207有320个特有基因,进而通过对特有基因进行KEGG通路的注释以及后酸化相关通路的分析得到6个与后酸化相关的基因,1.1011_GM000805、1.1011_GM002068、1.1011_GM000803、1.1011_GM000804四个基因是关于生物膜的形成,菌株的物质转运、1.1011_GM000260基因属于丙酮酸代谢通路,是乳酸生成过程的重要通路、1.1011_GM000194基因是蛋白水解的关键酶基因。在基因水平上为菌株KLDS1.1011较弱的后酸化特性提供了重要的理论依据。     

额尔齐斯河野生丁(鐬)肠道产蛋白酶菌株的初步鉴定及产酶条件的研究

采用酪素培养基和脱脂乳培养基筛选额尔齐斯河野生丁(鐬)肠道内产蛋白酶菌株,共获得40株蛋白酶产生菌,其中8株蛋白水解圈较大,菌株编号为P1～P8.选取水解圈直径最大的P15为出发菌株,进行生理生化鉴定,同时摇瓶发酵探讨最佳产酶条件.结果:生理生化反应将P5初步鉴定为芽孢杆菌;蛋白酶最适产酶条件为:40℃、初始pH7.0、接种量3%、15mL/250mL的装液量、180r/min、培养时间35h,最大产酶量168.3U/L;添加微量Mg2 、Mn2 、Ca2 有稳定酶活的作用.     

基于蔗糖代谢途径分析保加利亚乳杆菌的后酸化性能

弱后酸化能力是乳酸菌作为发酵剂使用时的重要特性。为研究保加利亚乳杆菌蔗糖代谢途径对发酵乳后酸化起到的作用，该研究比较了五株保加利亚乳杆菌的后酸化性能，分析了保加利亚乳杆菌的生长情况、糖代谢和产酸能力，探究了蔗糖代谢产酸相关基因的差异表达及关键酶活性，并研究了外源添加蔗糖代谢关键酶前后保加利亚乳杆菌的生长情况。结果表明，Lb. 1后酸化能力最弱，在以蔗糖为碳源的培养基中生长缓慢，KLDS 1.0207后酸化能力最强。发酵24 h后，二者蔗糖转化率分别为5.85%和85.39%，乳酸含量分别为1.13 g/L和11.81 g/L。在含双糖（乳糖:蔗糖=1:1.5）的MRS培养基中生长时，KLDS 1.0207蔗糖代谢途径中基因sacA、pgi、gap、pgk、ldh表达量极显著高于Lb. 1（P<0.01），KLDS 1.0207蔗糖酶活性显著高于Lb. 1（P<0.05），达到1.31 U/mg。在Lb. 1的蔗糖培养基中补充蔗糖酶后，OD600 nm增至原来的5倍。因此，蔗糖酶活性对保加利亚乳杆菌代谢蔗糖至关重要，编码蔗糖酶的sacA基因表达下调显著减弱蔗糖酶活性，菌株后酸化能力明显下降。     

保加利亚乳杆菌菊芋复合汁增菌培养基的优化筛选

以菊芋为主要原料,以自行分离选育的高活力保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)L.b-DR为试验菌株,研究了在菊芋汁培养基中添加单一营养因子对保加利亚乳杆菌L.b-DR细胞生长量的影响;利用正交试验优化筛选出保加利亚乳杆菌L.b-DR的菊芋复合汁增菌培养基。试验结果表明:在菊芋汁基础培养基中添加番茄汁、乳糖、蛋白胨、碳酸钙,可显著促进试验菌株的细胞生长(P<0.01);利用L934正交试验筛选出菊芋复合汁增菌培养基的最佳配比是:在菊芋汁培养基中添加7.5%番茄汁,1.5%乳糖,1%蛋白胨,0.3%碳酸钙。保加利亚乳杆菌L.b-DR经过复原脱脂乳培养基和液体MRS培养基活化后,以1%(约1×106cfu/mL)接入菊芋汁复合增菌培养基中,37℃培养16h,活菌数可达1.50×109cfu/mL,较对照菊芋汁培养基的活菌数提高23.96倍,与实验室常用的MRS培养基的活菌数相当,而其成本较实验室常用的液体MRS培养基的成本降低了2400元/t。     

产细菌素乳酸菌的筛选及对农家干酪保质期的影响

从实验室保存的7 株乳酸菌中,经分离纯化,以金黄色葡萄球菌为指示菌,筛选获得1 株高产细菌素的菌株KLDS 1.0338,排除有机酸和过氧化氢的干扰以及蛋白酶敏感性实验,确定抑菌作用是由细菌素产生的。通过菌株形态学分析,生理生化及16S rDNA分析鉴定菌株KLDS 1.0338为干酪乳杆菌ATCC 334。进一步利用该菌株制作农家干酪,考察4 ℃贮藏期间干酪的变化,添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌的实验组抑菌活性显著大于未添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌组（P＜0.01）,实验组的pH值下降平缓,可以有效延长农家干酪的货架期,并保持产品原有的色泽、风味、质构等感官特性。     

保加利亚乳杆菌水解酪蛋白能力及产物分析

为了深入研究保加利亚乳杆菌酪蛋白水解情况。本试验主要以保加利亚乳杆菌ATCC 11842作为研究对象,同时以保加利亚乳杆菌KLDS 08007、KLDS 08009、KLDS 08010、KLDS 08014和KLDS 08018作为对照研究,测定不同菌株发酵液的酪蛋白水解度和多肽含量,同时对ATCC 11842的酪蛋白水解产物进行SDS-PAGE电泳分析和LC-MS分析。结果表明:ATCC 11842的水解能力最强,水解度为13.89%,多肽含量为0.63 mg/m L。测定六株保加利亚乳杆菌细胞壁蛋白酶的活性与水解能力进行比较分析发现,该酶活性与菌株的水解能力呈正相关,ATCC 11842的酶活力最强,达到15.52 U/m L,比活力为6.73 U/mg。通过电泳图谱发现,随着发酵时间的延长,酪蛋白逐渐水解,并生成3.4~21.0 ku的多肽。对水解物进行LC-MS分析,酪蛋白水解后共产生77种6~25肽的片段,其中6~7肽占片段种类的9%,8~14肽占多肽种类的77%。     

酶水解脱脂乳培养基对植物乳杆菌KLDS1.0391发酵产抑菌物质的影响

以中性蛋白酶水解脱脂乳为培养基,研究脱脂乳水解度对植物乳杆菌KLDS1.0391发酵产抑菌物质的影响,并优化发酵pH和时间。采用毛细管电泳和SDS-PAGE技术分析不同水解度脱脂乳的肽分布,采用3.7L发酵罐,通过单因素试验确定发酵pH和时间。研究结果表明:15%水解度的脱脂乳中,酪蛋白被全部水解,乳清蛋白被部分水解,水解后的低分子量肽更易于被该菌利用;以15%水解度的脱脂乳为培养基,恒pH 5.0发酵24 h后,所产抑菌物质的抑菌活性最高,达538.53 IU/mL。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳体系中生长限制因子的研究

研究了维生素、碳源和氮源(蛋白胨、氨基酸)对植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳中生长情况的影响。试验结果表明,在脱脂乳中添加维生素、氨基酸、碳源对其生长及凝乳没有显著影响;添加鱼蛋白胨可显著促进Lb.plantarum ST-Ⅲ在脱脂乳中生长和凝乳过程。鱼蛋白胨溶液经过分子截留极限为5000ku的膜超滤的透过液也具有促进植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳中生长和凝乳的作用,该透过液经过Sephadex G-25和Sephadex G-15凝胶柱分离后,获得1个可以促进Lb.plantarum ST-Ⅲ在脱脂乳中生长和凝乳的单一峰,根据其洗脱体积,可以断定其主要成分为寡肽。因此,Lb.plantarum ST-Ⅲ胞内蛋白酶和肽酶活性较弱可能是限制其在脱脂乳中生长和凝乳的主要原因。     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

保加利亚乳杆菌产酸关键酶的研究

以四株德氏乳杆菌保加利亚亚种为出发菌株,详细比较了四株菌产酸关键酶酶活的差异,从而找出菌株KLDS 1.1006和KLDS 1.1011后酸化较弱的主要原因及控制其产酸的关键酶.结果表明,H+-ATPase可以控制菌株的能量代谢,是产酸关键酶;β-半乳糖苷酶对于分解乳糖产酸的贡献非常大,是乳糖代谢关键酶;乳酸脱氢酶和蛋白酶与后发酵产酸过程并没有必然联系;H+-ATPase和β-半乳糖苷酶酶活性较弱是引起菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011后酸化程度弱的根本原因.     

蛋白酶水解脱脂乳培养基的优化

为减少进口发酵剂的使用,降低国内乳制品的生产成本,国内需要自主研发发酵剂,水解脱脂乳培养基的优化是发酵剂制备过程中的一个重要环节。为制备有利于乳酸菌生长的水解脱脂乳培养基,本研究首先以发酵乳杆菌V9为试验菌种,筛选出水解脱脂乳最适的蛋白酶,再通过单因素与正交实验对制备脱脂乳水解液的温度、时间、pH值、加酶量进行优化。结果表明,最适水解条件为:在p H为8.5的12%脱脂乳中按25 U/mL接入碱性蛋白酶,55℃水解1 h,以此水解脱脂乳为培养基培养乳酸菌活菌数达到2.5×109CFU/mL,较脱脂乳培养基中的活菌数提高了1.74倍。利用此优化培养基培养鼠李糖乳杆菌grx19和植物乳杆菌S7,得到的活菌数分别较脱脂乳培养基提高了1.50和1.62倍。     

植物乳杆菌最适生长底物解析及高密度培养工艺

为提高植物乳杆菌的增殖浓度,分别测定菌株在添加不同氮源、不同缓冲盐、不同浓度的MnSO4和不同促生长物质时菌株的生长浓度。结果表明,酵母类氮源是植物乳杆菌的最适氮源,缓冲盐在恒pH培养时对菌株生长无促进作用,锰浓度与最高活菌数呈正相关,在以酵母浸粉为氮源时植物乳杆菌培养不需要添加其他生长因子。进一步优化菌株的最适pH值和碳氮比,基于可耐受渗透压,优化恒pH培养和恒pH自动反馈补料培养基和培养工艺,得到各菌株的最适培养策略。3株菌的最适氮源添加量为40~45 g/L,MnSO4的最适添加量为0. 25 g/L,最适碳氮比为对数生长期生长速率被抑制时的碳氮消耗比。恒pH 5. 5自动反馈补料培养植物乳杆菌X1,活菌数达到4. 1×10^10CFU/mL;恒pH 5. 5分批培养植物乳杆菌N8,活菌数达到2. 9×10^10CFU/m L;恒pH 6. 0分批培养植物乳杆菌N9,活菌数达到6. 2×10^10CFU/mL。该研究结果的应用将显著提高植物乳杆菌的工业化生产效率。     

培养条件对保加利亚乳杆菌中胞外肽酶PrtB基因表达的影响

目的：选择实验室保藏的保加利亚乳杆菌，探究不同的培养条件对其关键酶PrtB基因表达的影响。方法：利用实时荧光定量PCR测定生长时期、氮源、初始pH值（5.6，5.9，6.2和6.5）和培养温度（30，37，42 ℃和45 ℃）对PrtB基因表达的影响。试验结果表明，保加利亚乳杆菌LB08012、LB08014和LB08016从对数初期到稳定期，PrtB基因的表达量显著下调（P<0.05）；N缺乏条件与正常MRS培养条件相比，PrtB的表达量呈现明显增加的趋势（P<0.05），而添加酪蛋白胨与正常MRS培养条件相比，PrtB的表达量显著下调（P<0.05）；在初始培养pH值为5.9，6.2和6.5中的表达量与对照组（pH5.6）相比，LB08006、LB08007、LB08012和LB08016菌株的PrtB的表达量为增加（P<0.05），而LB08014、LB08015和LB08017菌株为降低（P<0.05）；在37，42 ℃和45 ℃时，LB08007、LB08012、LB08014和LB08015菌株的PrtB的表达量为先上升后下降，而LB08006、LB08016和LB08017为先上升后下降的趋势，45 ℃时PrtB的表达量最低，趋于0，较对照组（30 ℃）下降10.7倍。     

协同发酵在植物乳杆菌发酵乳中的应用研究进展

植物乳杆菌由于其益生功能受到广泛关注。植物乳杆菌蛋白水解系统不完全,存在肽转运系统和胞内肽酶,但缺乏胞壁蛋白酶,这导致该菌无法直接利用乳中蛋白质,因此在乳中生长不佳。利用蛋白酶活性强的乳酸菌和植物乳杆菌的协同发酵是一种解决方法,前者能初步水解乳中蛋白质产生多肽和游离氨基酸,为植物乳杆菌提供氮源,促进其生长。本文综述了植物乳杆菌益生功能,在乳中生长不良的原因及相关解决办法(添加营养物质、添加蛋白酶、协同发酵)的研究进展。     

氮源对德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3耐冻干能力的影响

本研究针对德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3,分别测定了其对16种氮源的利用情况,筛选出能够提高菌株冻干耐受的氮源种类及添加量,并进一步测定该氮源对菌株冻干粉发酵活力、菌体形态、发酵关键酶活力的影响。结果表明：氮源为30 g/L牛骨蛋白胨时可提高菌株冻干存活率及冻干粉发酵活力,冻干存活率由9.68%提高到18.90%,冻干粉平均发酵活力较对照组提高22.15%;电子显微镜显示,牛骨蛋白胨培养后菌体大小及形态有所改变,对照组发酵菌体表现出不规则、卷曲的形态且菌体较长,而牛骨蛋白胨为氮源时菌体形态呈表面光滑的短杆状,菌体长径比(l/d)和面积体积比(S/V)显著降低(P<0.05),可能与菌株更高的存活率和发酵活力有关。发酵关键酶活力测定结果表明,冷冻干燥显著降低菌株酶活力(P<0.05),牛骨蛋白胨培养菌株冻干后胞内酶活力均显著高于对照组(P<0.05),乳酸脱氢酶、Na⁺K⁺-ATP酶及β-半乳糖苷酶分别较对照组提高1.30、1.52及2.75倍,且胞外β-半乳糖苷酶活性低于对照组。结果证实,牛骨蛋白胨培养B61-3菌体能够抵...     

三株乳酸杆菌益生及免疫特性研究

试验以副干酪乳杆菌KLDS1.0351、植物乳杆菌KLDS1.0985及KLDS1.0986为对象,探究其耐人工胃液、肠液、耐胆盐能力及三株菌株对脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,三株菌株耐人工胃液、耐人工肠液和耐胆盐能力良好,副干酪乳杆菌KLDS1.0351强于植物乳杆菌KLDS1.0985和KLDS1.0986。乳酸杆菌对脾淋巴细胞活性的影响随活菌数量的增加而增大。活菌数为107 CFU/m L时,对脾淋巴细胞活性的影响为KLDS1.0986KLDS1.0351KLDS1.0985;KLDS1.0351对脾淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用,而KLDS1.0985和KLDS1.0986两株菌株只有活菌数达到107 CFU/m L时才有促进作用。     

弱后酸化保加利亚乳杆菌突变株与亲本菌株H+-ATPase基因的相似性比较

为了确定德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制,以H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株和亲本菌株KLDS1.9201作为研究对象.首先分别提取亲本和突变菌株的基因组DNA,随后利用PCR的方法扩增出H+-ATPase蛋白的全部编码基因并测序,最后利用DNAMAN软件比较亲本和突变菌株的H+-ATPase的相似性.结果表明亲本和突变菌株H+-ATPase编码基因的相似性为100％.H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株KLDS1.9201-11和亲本菌株KLDS1.9201的H+-ATPase活力之间的差异并不是由于编码基因发生了突变,可能是转录水平的降低导致H+-ATPase酶蛋白的表达量降低,进而影响酶活力.为进一步研究德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制奠定了基础.