猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的初步建立

目的 建立猪伪狂犬病病毒(PrV)的PCR检测方法 .方法 根据PrV gB基因序列,应用primer 5.0软件自行设计、合成一对引物进行PCR反应,优化反应条件,建立检测 PrV的PCR方法 ,并应用于临床样品的检测.结果 以PrV上海株细胞培养物DNA为模板,扩增出263 bp的特异性条带,对扩增产物进行克隆测序和BLAST在线比对,与 GenBank中PrV的gB序列一致.对临床样品进行PCR检测,与病毒分离结果 一致.结论 所建立的PCR方法 敏感、特异,可用于实验用猪伪狂犬病病毒的快速检测.     

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

三种检测扎幌样病毒方法的比较分析

目的 比较三种常用检测扎幌样病毒的方法，以选取适合我国标本的较优检测方法。方法 对收集到的169份粪便分别采用三种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行检测，扩增产物进行测序分析。结果 方法A、B、C检测阳性标本数分别为3份(排出诺瓦克病毒阳性标本后)、4份、1份。4份PCR产物测序分析只有1份为扎幌样病毒，其余为轮状病毒。结论 方法C特异枉最好，即半套式RT-PCR优于其它二种RT-PCR方法。     

PCR检测人巨细胞病毒感染的研究

目的：建立快速简便的聚合酶链反应(PCR)方法检测入巨细胞病毒(HCMV—DNA)。方法：根据国外文献报道的HCMV基因序列,利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物,扩增片段为370hp。结果：在370bp处出现DNA扩增带者为HCMV—DNA阳性。结论：PCR技术检测HCMV—DNA敏感、特异,有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。     

东莞市1例星状病毒核酸检测及分析

目的对星状病毒进行核酸快速诊断并对其部分核酸序列进行测序分析。方法采用RT-PCR、基因测序技术对标本中的核酸进行检测分析。结果 RT-PCR结果表明标本为星状病毒阳性,对PCR扩增产物测序得到了409bp长度的ORF2部分基因序列,经Blast比对发现其为Ⅰ型血清型,与北京分离的一株星状病毒序列（GenBank号FJ755403.1）最为相似,仅有一个C→T的核苷酸变异。但编码的氨基酸并无改变,均为甘氨酸（Gly）。结论应用PCR技术扩增星状病毒特定片段可用于病毒的快速检测,同时对扩增产物测序还可对病毒进行分型,并了解其基因变异情况。     

传染性软疣病毒MC148基因的克隆和序列分析

目的：克隆传染性软疣病毒(MCV)的MC148基因，研究其基因序列。方法：从传染性软疣患者皮肤上的软疣小体中提取病毒DNA，经PCR扩增并测序后构建于pUC19克隆载体上。对重组体pUC19-MC148再次进行测序。结果：扩增出约315bp的片段，PCR产物及克隆产物测序证明，基因序列与GenBank报道的相同。结论：成功克隆出MCV的MC148基因，为趋化因子拮抗剂的研究奠定基础。     

细小病毒B19诊断芯片探针的制备

目的 制备细小病毒B19诊断芯片探针。方法 利用Primer Premier5．0软件针对细小病毒B19基因保守区域设计PCR引物，纯化扩增产物，克隆鉴定。结果 序列分析表明，扩增片段均为细小病毒B19特异基因。结论 利用PCR扩增产物可制备细小病毒B19诊断芯片探针。     

蠕形住肠线虫的形态学及分子生物学鉴定

目的通过形态学与分子生物学方法,对检获虫体进行鉴定。方法对从粪便中检获的虫体及排出的虫卵进行形态学鉴定;提取虫体基因组DNA,用蠕形住肠线虫(简称蛲虫)18S rRNA基因片段特异性引物对其DNA进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测并送测序。结果与目的序列及GenBank中其他常见人体寄生虫18S rRNA基因序列进行比对并做同源性分析。结果镜下可见虫体头翼、咽管球和阴门,虫卵为长椭圆形,两侧不对称,符合蛲虫虫体和虫卵特征。PCR结果显示,扩增产物约150 bp,与预期片段大小一致。经BLAST比对及系统进化树分析,扩增产物测序与蛲虫18S rRNA吻合。结论该患者粪便检获虫体经形态学和分子生物学鉴定为蛲虫。本研究为建立蛲虫分子生物学诊断方法打下基础。     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

人细小病毒B19中国株VP1蛋白独特区基因片段序列变异分析

目的 研究B19病毒中国株独特区VP1的基因变异。方法 采用聚合酶链反应技术（PCR）从两侧中国再生障碍性贫血患儿血清中扩增VP1独特区基因片段，将其与PUC19连接，酶切鉴定筛选阳性克隆后测序分析。结果 从一个患儿的血清中扩增出约480bp目的片段，并成功构建PUC19－VP1质粒，测序结果显示，与国外已发表的Wi株VP1独特区序列相比，有2处核苷酸发生改变，并可致所编码的氨基酸变化。结论 中国B19病毒VP1独特区有变异。     

猫肾F81传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法

目的　建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法　在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果　在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。结论　原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点     

大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的 建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。 方法 根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物, 以H-1和KRV 病毒DNA为模板建立双重PCR方法, 对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠, 分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组, 感染后第2, 4, 6, 8, 10天采集大鼠粪便, 第10天处死所有大鼠, 采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织, 用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果 建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带, 敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/mL, 最低KRV量为0.73 pg/mL;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出, 特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸, 感染大鼠均无明显临床症状, 感染第10天采集组织, H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8), 肝50%(4/8), 脾62.5%(5/8), 肺50%(4/8), 肾37.5%(3/8), 盲肠内容物62.5%(5/8), 且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8), 肝25%(2/8), 脾87.5%(7/8), 肺12.5%(1/8), 肾25%(2/8), 盲肠内容物62.5%(5/8), 混合感染组检出率高于单独感染组。结论 建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染, 可作为实验动物国家标准的有力补充。     

副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液(血凝效价为1:1280)稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2.38%,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用

目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物，对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时，对其他病原菌抽提核酸扩增，并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段，与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测，检出31份阳性，与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

根据泰泽氏菌rDNA序列设计出二对特异引物，以标准菌RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的DNA为模板，进行套式PCR反应。结果用外引物扩增，泰泽氏菌和大肠杆菌均出现625bp的反应带，其它细菌无反应带；而用内引物第二次扩增，只有泰泽氏菌出现196bp的特异扩增带，将PCR方法应用于人工免疫抑制的SD大鼠，检出率为30％（9／30）。同时将此30份血清用间接免疫荧光法（IFA）进行检测，结果未检出阳性样品。结果提示，套式PCR方法具有特异性强、敏感性高，简便快速的特点。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测外周血CK19 mRNA

目的:应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,建立定量检测CK19 mRNA的方法. 方法:采用RT-PCR从胃癌细胞中克隆CK19片段(230 bp),装入pMD 18-T Simple载体.纯化质粒,制备荧光定量PCR标准品.应用LightCycle荧光定量PCR仪检测标准品、30例正常人外周血和5例肿瘤组织CK19 mRNA. 结果:PCR扩增及测序均证实CK19 cDNA片段重组到pMD 18-T载体上,建立了稳定的检测CK19 mRNA的标准,即设定CT值在35个循环之内,检测结果低于100个拷贝数量级为阴性标本.结论:采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术检测外周血CK19 mRNA是一种稳定可靠的方法.