副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析

目的分析副粘病毒Tianjin株NP蛋白与其他SeV的同源性及种系进化关系,探讨其变异及抗原性。方法克隆NP基因,对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性及进化分析。在原核系统中分3段表达NP蛋白。结果经Western blot分析,重组蛋白NP1、NP2和NP3能与副粘病毒Tianjin株抗血清特异反应,具有天然抗原性。Tianjin株与仙台病毒BB1株NP的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.5%和96.2%,与其他仙台病毒的同源性,在85.1%～88.7%和92.4%～94.7%之间。Tianjin株NP蛋白共有15个独特的氨基酸变异位点和11个与BB1株共有的变异位点。Tianjin株与BB1株NP核苷酸序列的差异大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异。结论副粘病毒Tian-jin株属于仙台病毒新的进化分支。重组NP蛋白具有抗原性。     

留学生医学微生物教学的几点体会

本文针对多年的留学生教学中取得的经验、存在的一些问题及应对措施进行了总结和探讨。     

仙台病毒 Tianjin 株缺陷干扰颗粒体内外诱导大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的探讨仙台病毒Tianjin株缺损干扰颗粒（ defective interfering particles ,DI颗粒）体内外诱导大鼠脑胶质瘤细胞C6凋亡的作用。方法将不同滴度仙台病毒Tianjin株DI颗粒分别与大鼠脑胶质瘤细胞C6作用不同时间,以培养基作为阴性对照、完整病毒作为阳性对照,通过DNA片段琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色、AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪分析等检测细胞凋亡情况。建立大鼠皮下胶质瘤模型,通过测量肿瘤大小观察DI颗粒抑瘤作用,病理切片HE染色观察肿瘤组织病理变化,TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果 C6细胞在体外经DI颗粒诱导后, DNA片段琼脂糖凝胶电泳呈阶梯状;流式细胞仪及TUNEL检测显示,DI颗粒组与完整病毒组细胞凋亡率明显增高,且呈时间-剂量依赖型。动物实验结果显示,DI颗粒和完整病毒均可明显抑制肿瘤生长;肿瘤组织病理切片HE染色显示DI颗粒组和完整病毒组瘤结节内瘤细胞较少;TUNEL原位细胞凋亡检测显示DI颗粒组和完整病毒组凋亡细胞明显增加,以上结果与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P＜0．01）。结论仙台病毒Tianjin株DI颗粒在体内外均能引起大鼠脑胶质瘤C6细胞凋亡,且呈时间-剂量依赖型,提示DI颗粒有辅助治疗脑胶质瘤的可能性。     

紫外线灭活仙台病毒诱导人胶质瘤细胞系LN229凋亡作用(英文)北大核心CSCD

目的探讨紫外线灭活仙台病毒致人胶质瘤LN229细胞凋亡作用及其机制。方法用不同剂量灭活病毒感染LN229细胞,24h后,MTT法检测灭活病毒对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;分光光度法检测caspase活性;Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果 MTT检测显示灭活仙台病毒能够剂量依赖性抑制LN229细胞增殖;流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高;caspase活性测定显示灭活病毒组细胞中caspase-3,-8和-9蛋白活性呈剂量依赖性增加;Western blotting结果显示,随着灭活病毒滴度增加,细胞中Bax、细胞色素c、Fas、FasL表达水平升高、而Bcl-2、caspase-8前体、caspase-9前体和caspase-3前体蛋白表达下降。结论灭活仙台病毒能够诱导LN229细胞剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体途径和死亡受体途径相关。     

新型抗生素S632A对单纯疱疹病毒Ⅰ型感染小鼠的治疗作用

目的研究新型抗生素S632A对单纯疱疹病毒Ⅰ型感染小鼠的治疗作用。方法建立小鼠单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)模型，观察给药后小鼠存活率和平均存活时间，并检测给药后不同时间小鼠脑组织病毒滴度，以及HE染色观察给药组小鼠脑组织病变程度。结果实验结果显示28mg／kg治疗剂量的S632A能够明显降低小鼠死亡率，延长其平均存活时间，降低脑组织病毒滴度，减轻脑组织病变程度，且与阳性对照药物阿昔洛韦(ACV)治疗效果类似，统计学上无显著差异。结论一定剂量的S632A在小鼠体内具有类似于ACV的治疗作用，值得进一步研究和开发。     

副黏病毒Tianjin株重组血凝素-神经氨酸酶单克隆抗体的制备及在临床检测中的初步应用

目的:建立双抗体夹心ELISA法,调查副黏病毒Tianjin株引起婴幼儿下呼吸道感染情况。方法:用纯化的重组HN片段免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体。以兔抗Tianjin株多克隆抗体为捕获抗体,单抗G7G7E7为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测104例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本。结果:获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株G7H4D3、G7D9G3和G7G7E7。3株单克隆抗体与副黏病毒Tianjin株有较高结合活性,与甲、乙型流感病毒,新城疫病毒(NDV),人副流感病毒(hPIV)1型、3型、肺炎支原体均无交叉反应性。ELISA相加试验和阻断试验表明,3株单抗识别相同或相近表位区域,识别的表位在抗病毒免疫应答中处于免疫优势地位。双抗体夹心ELISA法检测阳性率为1.92%(2/104)。结论:与RT-PCR和间接ELISA法比较,双抗体夹心ELISA法,具有敏感性高、特异性强的优点,适于临床检测使用。副黏病毒Tianjin株是婴幼儿下呼吸道感染的重要致病因子之一。     

CD155依赖m6A修饰调控宫颈癌细胞的恶性行为

目的:探究CD155在宫颈癌中的作用和依赖m6A修饰的调控机制。方法:应用数据库预测宫颈癌细胞中CD155（PVR）的表达情况，CD155对患者预后的影响，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定宫颈癌细胞HeLa和宫颈永生细胞S12中CD155的表达水平。分别运用MTT、平板克隆、迁移侵袭等实验评估CD155对宫颈癌细胞HeLa生长、增殖、迁移和侵袭的影响。应用Western印迹法测定E-钙黏蛋白（E-cad）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平并评价CD155对EMT的影响。MeRIP-RT-qPCR检测CD155是否受m6A 调控，Western印迹法和qRT-PCR测定METTL3是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平。放线菌素D处理细胞后检测METTL3对CD155RNA半衰期的作用，利用预测网站m6ATaget预测CD155RNA甲基化位点的识别者（Reader），运用Western印迹法和qRT-PCR分析YTHDF1是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平，放线菌素D处理细胞后检测YTHDF1对CD155RNA半衰期的作用，RIP-RT-qPCR实验进一步确定YTHDF1和YTHDF1-mut对CD155RNA下拉能力。结果: CD155在宫颈癌组织和细胞中表达较高，体内高表达CD155的患者生存率较低。相比S12细胞，HeLa细胞中CD155的表达增加（t=3.749，P<0.05）。CD155的高表达促进了体外宫颈癌细胞的生长（t=3.152，P<0.05）、增殖（t=3.706，P<0.05）、迁移（t=5.422，P<0.01）和侵袭（t=3.599，P<0.05），抑制E-cad的表达促进了Vimentin的表达。MeRIP-RT-qPCR结果显示CD155RNA受m6A调控，METTL3促进了CD155蛋白和RNA（t=6.725，P<0.05）的表达，敲降METTL3之后CD155RNA半衰期降低（t=5.622、6.063、5.857，均P<0.05）。敲降YTHDF1之后CD155的蛋白水平降低，CD155RNA半衰期降低（t=10.93、5.602、4.359，均P<0.05）。在YTHDF1高表达的细胞中，CD155RNA被有效免疫沉淀（t=4.686，P<0.01），但在YTHDF1-mut转染的细胞中，免疫沉淀结果显示下拉的CD155RNA水平明显降低（t=4.462，P<0.05）。结论:CD155RNA在m6A修饰的情况下，被YTHDF1特异性识别，进而稳定性增强和翻译增加，CD155表达增加促进了宫颈癌细胞的恶性行为。     

副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液(血凝效价为1:1280)稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2.38%,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。     

副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液（BALF）标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液（血凝效价为1：1280）稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2．38％,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。【