抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

利福霉素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备利福霉素单克隆抗体,并建立利福霉素竞争ELISA检测方法。方法通过利福霉素与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,建立利福霉素竞争ELISA检测方法。结果筛选出5株能稳定分泌抗利福霉素单抗的杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,其中2H1、5H5、3F12和2C8株的轻链是κ链,3A2株的轻链是λ链;5株单抗为同一位阻群;在碱性条件下较稳定。建立的利福霉素竞争ELISA检测法灵敏度为6ng/ml,与利福平无交叉反应,稳定性良好。结论已成功制备了利福霉素单克隆抗体,并建立了利福霉素竞争ELISA检测法。     

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

甲型副伤寒细菌单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备甲型副伤寒特异性多糖(O-specific polysaccharide,O-SP)单克隆抗体,建立鉴定甲型副伤寒沙门血清型细菌的全菌体ELISA和O-SP的竞争ELISA定量检测方法。方法用甲型副伤寒全菌体免疫小鼠,通过常规方法融合,以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体偶联的O-SP为筛选检测抗原,间接ELISA法筛选分泌抗甲型副伤寒O-SP的特异性抗体杂交瘤细胞株;分别以甲型和乙型副伤寒的O-SP-TT及伤寒Vi-TT为包被抗原,检测制备的单克隆抗体与不同血清型细菌多糖的交叉反应;以不同沙门菌菌体为包被抗原,用制备的1株甲型副伤寒O-SP特异性单克隆抗体进行菌体间接ELISA,检测细菌血清型;用该株单克隆抗体为竞争抗体,建立定量检测样品中O-SP的竞争ELISA方法。结果筛选出6株分泌抗甲型副伤寒O-SP抗体的杂交瘤阳性细胞株;其中2株仅与甲型副伤寒O-SP呈特异性反应,其余4株与乙型副伤寒O-SP呈交叉反应;用其中1株单克隆抗体进行的菌体间接ELISA显示,该株单克隆抗体仅与甲型副伤寒沙门菌反应,而不与伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和肠炎沙门菌反应;竞争ELISA定量检测O-SP的检测范围在0.4~0.003 2μg/ml最准确。结论制备的特异性抗甲型副伤寒O-SP的单克隆抗体可用于甲型副伤寒细菌血清型快速鉴定和O-SP的竞争ELISA定量检测。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

牛血清白蛋白单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的筛选高效抗牛血清白蛋白(BSA)单克隆抗体细胞株,并建立BSA抗原检测的双抗体夹心ELISA法。方法分别采用辛酸-硫酸铵法和葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化单抗,并进行抗体类型、腹水效价、特异性和相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立BSA双抗体夹心ELISA检测法,并进行初步应用。结果筛选出4株可稳定分泌抗BSA单抗的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG,抗体滴度均可达10-6,特异性良好,相对亲和力较高。建立的双抗体夹心ELISA法线性范围为1.25～20ng/ml,R2>0.98,灵敏度为1.25ng/ml。结论已筛选出高效抗BSA的单抗,并建立了BSA双抗体夹心ELISA检测方法。     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。     

抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠的制备及初步应用

目的制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,并进行初步应用。方法采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗荧光素单克隆抗体;制备腹水,经50%硫酸铵粗提后,再经阴离子交换树脂DE52进一步纯化单克隆抗体;采用氧化共沉淀法制备纳米磁性粒子;乳液聚合法制备羧基磁性微球;用碳二亚胺将抗荧光素单克隆抗体共价偶联于磁性微球表面,制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠。用制备的免疫磁珠检测乙肝表面抗原,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果共获得5株杂交瘤细胞株,其中1F12细胞株分泌的抗体效价、相对亲和力较高,特异性较好;纯化的1F12株单抗的纯度达95%,蛋白含量为2.4 mg/ml,ELISA效价为106,相对亲和力为0.2 mg/L,与FITC标记的BSA可特异性结合;纳米磁性粒子的平均粒径为150 nm,铁含量为71.63%;羧基磁性微球的平均粒径为210 nm,羧基含量约为2.15 mmol/g;每克羧基磁性微球可结合抗荧光素单克隆抗体约12 mg,制备的免疫磁珠可有效结合荧光素标记的蛋白。应用抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠检测乙型肝炎表面抗原的灵敏度高于ELISA试剂,检测限达0.1 ng/ml。结论成功制备了抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,其具有应用于免疫检测分析的价值。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备

目的表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体。方法将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化。用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。结果表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol。免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L。以此单抗为包被抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的最佳检测范围为1.5625～25ng/ml。结论成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础。     

抗DNA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其抗体的鉴定

目的制备抗DNA单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的外源性DNA残留量测定方法。方法将小牛胸腺DNA与阳离子化的牛血清白蛋白通过Mannich反应连接成为完全抗原,免疫BALB/c小鼠得到的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获得稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行纯化、浓缩及鉴定。结果得到3株可稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,单抗的ELISA间接效价分别为1∶4×103、1∶8×104和1∶1×103;亚型分别为IgM/κ、IgM/λ和IgM/κ;亲和力常数分别为3.96×108、4.04×109和1.26×108L/mol;3株细胞分泌的单抗与ctDNA、DH5αDNA、GS115DNA和H.S.DNA均有较高的结合能力,而对RNA、BSA和酪蛋白结合较弱或不能结合;3株细胞分泌的单抗识别3个不同的抗原表位;可检出4ng/ml以上的DNA。结论成功制备了3株细胞分泌的抗DNA单抗,为外源性DNA残留量免疫测定方法的深入研究奠定了基础。     

镉离子单克隆抗体的制备及其阻断ELISA检测方法的建立

目的制备重金属镉离子(Cd2+)单克隆抗体,并建立Cd2+残留阻断ELISA检测方法。方法用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合Cd2+合成Cd-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备免疫抗原Cd-ITCBE-BSA和检测抗原Cd-ITCBE-OVA,并进行鉴定;用Cd-ITCBE-BSA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,间接ELISA和阻断ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备Cd2+单抗,并进行鉴定;建立检测Cd2+残留的阻断ELISA法,并进行验证。结果 Cd-ITCBE-BSA和Cd-ITCBE-OVA中BSA与OVA含量分别为7.1和6.7 mg/ml,Cd2+含量分别为191.7和130.1μg/ml;共筛选出1A3、2B7、2E10、4F3 4株杂交瘤细胞,其中2E10株分泌的Cd2+单抗效价最高,细胞培养上清和腹水的间接ELISA效价分别达1∶4.32×102和1∶5.12×105,亲和常数(K)a也最高,为7.58×108 L/mol,对Cd2+的半数抑制浓度(IC50)为16.3μg/L;建立的阻断ELISA法的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合;最低检测限为5μg/L;饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为92.9%和88%,平均变异系数分别为12.35%和12.45%;与Hg2+的交叉反应率为96.5%,与其他化合物未见交叉反应;试剂可在4℃保存180 d。结论已成功制备了高亲和力的Cd2+单抗,并建立了快速、简便、敏感、特异的Cd2+残留阻断ELISA检测方法。