靶向Pin1基因的shRNA干扰质粒的构建及其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用

目的构建靶向Pin1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰真核表达质粒,并检测其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用。方法设计合成特异性针对人Pin1基因的寡核苷酸序列,退火后与pGenesil-1载体连接,构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pGenesil-1-Pin1(+),利用脂质体转染大肠癌SW620细胞,以质粒pGenesil-1-Pin(-)转染细胞和未转染细胞为对照。利用荧光显微镜观察转染后细胞表达的绿色荧光蛋白,估算转染效率;应用实时荧光定量PCR和Western blot检测其对SW620细胞Pin1基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果所构建的特异Pin1shRNA真核表达质粒经酶切及测序证明构建正确,转染SW620细胞的转染效率为64%。shRNA对SW620细胞Pin1基因mRNA的抑制率在转染后72h最高,为70.2%,蛋白抑制率为60%。结论已成功构建了靶向Pin1基因的shRNA干扰真核表达质粒,可抑制SW620细胞Pin1基因mRNA的转录及蛋白的表达。     

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。     

人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%。结论已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。     

人葡萄糖调节蛋白78基因磷酸化位点的真核突变载体的构建及表达

目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因编码区磷酸化位点的真核突变载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中进行表达。方法利用定点诱变技术将GRP78基因的两个磷酸化位点进行突变,即203位苏氨酸(T)用丙氨酸(A)替换,466位酪氨酸(Y)用苯丙氨酸(F)替换,以质粒pEGFP-N1-GRP78为模板,进行PCR扩增后,构建突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F),并进行DNA测序分析。将测序正确的突变质粒转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot法检测融合蛋白在细胞中的表达。结果突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F)经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;突变质粒组荧光蛋白表达分布于细胞质内,细胞核内无表达产物分布;3个突变质粒转染组在相对分子质量约105 000处均可见目的蛋白条带,大小与预期相符。结论成功构建了人GRP78单突变T203A、Y466F和双突变T203A/Y466F真核表达载体,并可在肝癌SMMC-7721细胞中表达,为进一步研究GRP78基因磷酸化位点T203、Y466在肝肿瘤侵袭和转移中的作用奠定了基础。     

miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控

目的探讨miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控作用。方法人工合成miRNA-21序列,插入到质粒pGenesil-1中,构建重组真核表达质粒,并转染至肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞PTEN基因mRNA转录水平和蛋白的表达水平。结果经酶切和测序鉴定,表明重组真核表达质粒构建正确。转染重组真核表达质粒的A549细胞PTEN基因mRNA转录水平与未转染组相比,差异无统计学意义,蛋白表达水平较未转染组明显降低。结论miRNA-21可能主要在翻译水平调控PTEN基因的表达。     

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。     

Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。     

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。     

转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响

目的构建转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)基因短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF-β1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列,并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-β1a、pshRNA-TGF-β1b和pshRNA-TGF-β1c(阴性对照),以脂质体介导转染SW480细胞,荧光显微镜观察转染情况;RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果 TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比,3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达;pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低(P<0.05);SW480细胞的侵袭能力也明显降低(P<0.05)。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒,其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达,并可显著降低细胞的侵袭能力,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。     

粉煤灰中烧失量检测的不确定度分析

以F类粉煤灰为例,详细介绍了测定粉煤灰中烧失量的步骤、计算数学模型、影响测量不确定度的因素以及各项测量不确定度分量评定,人员、设备、材料、方法、环境都是影响测量不确定的因素。     

几种乙炔加压设备性能的比较

阐述并比较了几种加压设备在乙炔加压清净过程中的性能和特点。     

A study of miscibility of blends of polybutadienes of varying microstructure

The miscibility of various amorphous polybutadienes with mixed microstructures of 1,4 addition units (cis, 1,4 and trans 1,4) and 1,2 addition units have been investigated. The studies here involved optical transparency, differential scanning calorimetry, and small angle light scattering. It was found that a 90 percent (cis) 1, 4 addition polybutadiene was immiscible with high (91 percent) 1,2 addition polybutadiene. Reduction of the 1,2 content to 71 percent induced an upper critical solution temperature (UCST) with the cis 1,4 polymer. Polybutadienes with 50 percent and 10 percent 1,2 contents were miscible above the crystalline melting temperature of the cis 1,4 polybutadiene. Immiscibility of the 91 percent 1,2 addition polymer was also found with a 10 percent 1,2 polybutadiene. The latter polymer also exhibits an UCST with the 71 percent 1,2 polymer. The results are used to interpret the characteristics of blends of polybutadienes of varying microstructure.     

Process of acceleration of filtration of viscose

Conclusions It is significant that the purification on a single passage of viscose through porous ceramic corresponds to the result of a two-stage filtration of it in industrial filter-presses with standard fillings.Kiev Combine. Kiev Technological Institute of Light Industry. Translated from Khimicheskie Volokna, No. 3, pp. 20–22, May–June, 1969.