HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达

目的 建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1稳定表达的HepG2肝癌细胞系.方法 设计NY-ESO-1的引物,PCR法从NY-ESO-1阳性表达的睾丸癌组织中扩增出目的片段,克隆至T载体,双酶切后定向连入pCDNA3.1载体,构建pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒.经酶切、PCR、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转入HepG2细胞,G418药物筛选出稳定转染的细胞系,RT-PCR法、间接免疫荧光法分别检测稳定转染HepG2细胞中NY-ESO-1基因、蛋白的表达水平.结果 构建的pCDNA3.1/NY-ESO-1质粒经酶切、测序等检验表明质粒构建成功,筛选获得稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞.结论 构建了pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒及稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株,为下一步以NY-ESO-1为靶标进行肝癌的抗原特异性免疫治疗研究奠定了实验基础.     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定

目的：构建高迁移率蛋白A2（HMGA2）基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,为进一步研究HMGA2 基因功能奠定理论基础。方法：采用RT-PCR 方法从人乳腺上皮HBL-100 细胞中扩增HMGA2 基因全长cDNA,扩增产物经双酶切及凝胶回收后,直接克隆至黄绿色荧光真核表达载体YFP-C1中,构建YFP- C1-HMGA2重组质粒。将YFP-C1-HMGA2真核表达载体转染到人前列腺癌PC3细胞中,通过RT-PCR方法验证所构建的真核表达质粒YFP-C1-HMGA2的正确性。结果：RT-PCR获得长度为351　bp的HMGA2全长cDNA,经YFP-C1真核表达载体克隆、酶切鉴定及测序分析,测序结果示基因序列与GenBank序列一致,证实真核表达质粒YFP-C1-HMGA2构建成功,并且能够在真核细胞中表达。结论：成功克隆了HMGA2基因,构建了YFP-C1-HMGA2重组质粒。     

脑脊液来源人类免疫缺陷病毒tat真核表达载体的构建及鉴定

目的：探讨脑脊液来源人类免疫缺陷病毒（HIV）tat真核表达载体的构建,并研究TAT蛋白在真核细胞的表达。方法从脑脊液中扩增出HIV tat基因,构建pcDNA-tat真核表达载体,所构建载体经酶切和测序鉴定。将构建的表达载体转染293T细胞系,通过免疫荧光检测TAT蛋白的表达。结果成功扩增tat基因,酶切和测序结果证实正确构建了表达载体pcDNA-tat,免疫荧光证实所构建载体能在293T细胞中有效表达HIV TAT目的蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA-tat,为了解HIV在中枢神经系统的潜伏机制奠定实验基础。     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

ephrinB2真核表达载体的构建及其在Hela细胞的表达

目的构建ephrinB2重组真核表达载体,研究该质粒在细胞中的表达,为研究ephrinB2对肿瘤生长及血管生成的影响奠定基础。方法逆转录获得人ephrinB2全长cDNA序列,连接到pEGFPN1上,转化大肠杆菌,脂质体转染Hela细胞。RT-PCR检测转录情况,WB鉴定目的蛋白表达。结果酶切和测序证实正确构建重组质粒,并在Hela细胞中表达。结论成功构建了pEGFPN1-ephrinB2真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究ephrinB2的功能奠定基础。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究

目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.     

真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6 P-1-GST-PTEN构建

目的构建人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。