云南不同仓储地复烤烟叶表面醇化期间可培养真菌的动态变化

为了解云南复烤烟叶(K326)异地醇化过程可培养真菌的多样性,通过形态特征观察、18S rDNA序列分析研究了异地醇化过程中真菌菌群的结构。结果表明,从220份复烤烟叶样品中共分离、纯化到2 963株可培养真菌。4个醇化地烟叶表面真菌数量随醇化时间的延长呈"下降-上升-下降-趋于平缓"的趋势。结合形态特征和18S rDNA序列的分析结果,共鉴定出39个属(种)的真菌。不同醇化地、不同醇化时间复烤烟叶表面真菌的种群结构及其变化规律均有差异,但根霉属真菌始终为优势菌群。     

醇化过程中烤烟烟叶表面可培养真菌的多样性

为研究醇化过程中烤烟烟叶表面可培养真菌的多样性,选取国内外25个不同产地、等级的正常、霉变烟叶为研究对象,利用平板分离和分子生物学方法对烟叶表面的可培养真菌进行鉴定和系统发育分析。从415株真菌中挑选具有代表性的77株真菌进行ITS分析。结果表明:(1)从霉变烟叶中分离到的真菌,其多样性高于正常烟叶。(2)除7株真菌无法准确鉴定外,其余70株真菌分布在3个门、8个纲和30多个属中。优势菌属为曲霉属(Aspergillus)、分子孢子菌属(Cladosporium)和根霉属(Rhizopus),占比分别为22.9%、7.1%和7.1%。(3)从进口烟叶中分离到了特异的属,包括短梗霉属(Aureobasidium)、Myrmaecium和锥毛壳属(Coniochaeta)。表明醇化过程中烤烟烟叶表面的可培养真菌的多样性高,且真菌类别与烟叶产地密切相关。控制曲霉属真菌的生长繁殖是降低醇化烟叶霉变发生率的关键。     

气调醇化过程中片烟细菌群落结构的变化

气调醇化是片烟醇化的一种方法。微生物尤其是细菌在片烟醇化过程中对烟叶的吸食品质起着至关重要的作用。为研究气调醇化过程中片烟细菌群落结构变化规律,利用Illumina MiSeq测序平台比较气调防霉杀虫阶段（S1）、气调醇化阶段（S2）及气调保质阶段（S3）共36份样品的细菌16S rDNA序列的多样性。结果表明,从S1到S3的过程中,片烟中细菌的物种丰富度和多样性水平呈增加趋势。S1阶段片烟的优势种群为鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属和甲基杆菌属,其占比在整个气调醇化过程中呈逐渐下降趋势;S2阶段的优势种群为芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和伯克霍尔德菌属,其中芽孢杆菌属和伯克霍尔德菌属在整个气调醇化过程中占比呈先上升后下降的趋势;S3阶段细菌种群分布较为均匀。非度量多维尺度分析结果表明,3个醇化阶段的样品可以较明显地区分开来。可见,气调醇化过程中片烟的细菌种群组成非常丰富,不同醇化阶段活跃的微生物类群有所不同,鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属和甲基杆菌属主要在醇化前期参与了烟叶醇化过程,而芽孢杆菌属和伯克霍尔德菌属则主要在醇化后期发挥着微生物醇化的作用。     

不同产地和部位对片烟自然醇化过程中细菌群落结构的影响

为探明不同产地及不同部位的片烟在自然醇化过程中细菌群落结构的差异,以福建三明尤溪、云南曲靖沾益、贵州黔南长顺、河南驻马店确山4个产地,上中下3个烟叶部位的12份自然醇化片烟为材料,利用Illumina Mi Seq测序平台对自然醇化片烟中细菌16S rDNA进行高通量测序分析。结果表明:12份自然醇化片烟样品共获得940个操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)。福建三明尤溪C3F自然醇化片烟细菌群落的多样性最丰富。12份样品细菌群落的优势菌门均为变形菌门,大多数样品的优势菌属为鞘氨醇单胞菌属。不同产地自然醇化片烟细菌OTU的韦恩图分析表明,4个产地共有的OTU数量为195个,福建三明尤溪、云南曲靖沾益、贵州黔南长顺和河南驻马店确山特有的OTU数量分别为300、9、4和0个。     

烤烟自然醇化和人工醇化过程中感官质量的变化

为明确烟叶最佳醇化方式和醇化时间,从而提高烟叶品质、节省醇化成本,以山东诸城复烤后的中部烤烟烟叶为试验材料,对人工醇化和自然醇化过程中烟叶感官评吸指标进行了评价分析。结果表明,两种醇化方式下诸城复烤烟样品的最佳醇化时间均为18个月左右;与自然醇化相比,人工醇化方式对烟叶品质提升效果更好。根据原料库存情况和品质需求采用合适的醇化方式和醇化时间,有利于卷烟企业提高烟叶质量、节约企业成本。     

造纸法再造烟叶浓缩液中微生物群落结构分析及应用

为明确造纸法再造烟叶浓缩液中微生物群落结构与组成,以及微生物发酵对浓缩液特性的影响,以河南卷烟工业烟草薄片有限公司的浓缩液为原料,利用Illumina MiSeq测序平台对浓缩液内真菌18S rDNA和细菌16S rDNA进行测序分析,获得了浓缩液内真菌和细菌的种群组成和丰度,并考察了不同发酵时间(24、48和72 h)对浓缩液还原糖和总糖含量和再造烟叶感官品质的影响。结果表明:造纸法再造烟叶的浓缩液中真菌18S rDNA获得了548个OTU,细菌16S rDNA获得5 295个OTU,浓缩液微生物的群落结构主要由80.98%的真菌种群和19.02%的细菌种群构成,而真菌种群的丰富度和多样性低于细菌。真菌种群中的优势菌属为酿酒酵母属(Kazachstania)、假丝酵母属(Candida)和Ogataea;而细菌种群优势菌属主要为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)和Aeribacillus。经30℃发酵48～72 h时,浓缩液还原糖和总糖含量下降幅度大;发酵72 h后的浓缩液制备的再造烟叶,可改善卷烟舒适性,提高卷烟香气量。     

醇化烟叶表面可培养微生物的鉴定和系统发育分析

以K326烤烟品种为材料,对不同醇化时间烟叶表面的可培养微生物进行了分离,并通过分子生物学方法对这些微生物的种、属分类地位和系统发育关系进行了分析.结果表明:醇化烟叶表面可培养微生物的数量和种类随着醇化时间的延长呈明显的下降趋势;醇化烟叶表面的细茵主要包括芽孢杆茵和肠杆茵两个类群,其中,芽孢杆菌属的细菌为优势微生物类群.此外,醇化烟叶表面细菌的数量和烟叶部位等级也存在一定的相关性,即中部烟叶样品中细菌的数量高于下部烟叶样品,而上部烟叶样品中的细菌数量最少.而真茵的数量和种类与醇化时问和烟叶样品部位等级之间没有明显的相关性.     

陈化发酵期间烤烟叶面微生物活性及其应用研究

对未发酵、自然陈化及人工发酵期间的烤烟叶面微生物进行了分离、鉴定，并对不同发酵过程中微生物动态变化作了比较，结果表明：未发酵烤烟叶面微生物数量最多，随着自然陈化及人工发酵的进行，叶面微生物数量均逐渐减少，且均以能产生芽孢的芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｕｓ）和梭状芽孢杆菌属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）为优势种群，没有酵母菌的存在。在自然陈化过程中，霉菌数量逐渐减少，至陈化后期，基本上未能检出；而人工发酵过程中霉菌数量有所增加。将分离筛选到的几株优势菌混合配制成生物制剂（ＴＦＡ）用于烟草发酵，结果表明：ＴＦＡ可加速烤烟发酵，提高发酵烟叶品质，同时具有抑制烟叶霉变的作用。     

烤烟烘烤过程中微生物的动态变化

为研究烤烟在烘烤过程中微生物数量及优势群体的变化,对下、中、上三部位烤烟在烘烤过程中真菌、细菌进行了连续分离计数。结果表明,烘烤过程中不同部位烟叶含微生物量的变化趋势基本一致。真菌含量呈先下降后上升的变化趋势,42℃烟叶全黄时达到最高。细菌量从烘烤阶段开始逐渐增多,38℃烟叶八成黄时达到最高。不同部位烟叶烘烤过程中优势微生物的种类不完全相同,鉴定出优势真菌属5种,其中青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)出现频率最高;优势细菌属11种,其中棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Arthrobacter)、泛菌属(Pantoea)出现频率最高。     

以18S rDNA序列鉴定一株产纤维素酶真菌

采用18S rDNA序列分析和形态鉴定对一株具有较高纤维素酶活性的真菌HY12进行了鉴定.18S rDNA序列分析表明,菌株HY15与木霉属多株菌的18S rDNA的同源性均在99.0%以上,而与其中的绿色木霉(Trichoderma viride)同源性达到100.0%.从构建的系统进化树中可以看出,HY12与Trichoderma viride共同构成一个分支,并与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)聚成一大枝.该菌形态鉴定与绿色木霉比较接近,因此初步确定菌株HY12为绿色木霉菌.     

赤星病烤后烟叶内生及叶际真菌分析

  背景  由Alternaria alternata引起的烟草赤星病是烟叶成熟期主要真菌病害,在大田期和烘烤期均会造成严重危害,该病害的发生与叶片内生及叶际真菌群落密切相关。  方法  本文以健康与感赤星病烤后烟叶为研究对象,通过PCR技术扩增真菌18S rRNA转录间隔区的ITS1区,采用Illumina Miseq高通量测序技术分析赤星病烤后烟叶内生及叶际真菌群落结构与多样性。  结果  链格孢属Alternaria为赤星病烤后烟叶的优势菌属,相对丰度>70%;其次为红酵母属Rhodotorula,相对丰度>10%,其余真菌属相对丰度均小于1%。链格孢属和红酵母属均为健康烤后烟叶的优势真菌,但二者的相对丰度之和小于赤星病烤后烟叶;健康烤后烟叶中相对丰度>1%的菌属还包括曲霉属Aspergillus、Wallemia等。Alpha多样性结果表明,赤星病烤后烟叶真菌群落丰富度和多样性指数均低于健康烤后烟叶。  结论  赤星病烤后烟叶内生及叶际真菌群落多样性低于健康烤后烟叶,其优势菌属为链格孢属和红酵母属。      

烟草种子内生真菌群落结构和多样性分析

种子内生菌对种子的生长发育具有重要作用。为深入了解烟草种子内生真菌群落结构与多样性,以ITS区的rDNA为靶标序列,采用Illumina MiSeq测序技术对K326、云烟85和云烟87烟草种子内生真菌群落结构组成和多样性进行测定分析。结果表明,3个品种烟草种子共获得342 264条序列,聚类到110个分类操作单元（OTU）,分别属于5个门、13个纲、24个目、34个科、56个属。品种K326和云烟85种子内生真菌群落结构相似,多样性均高于云烟87。其中赤霉菌属Gibberella、小画线壳属Monographella、链格孢菌属Alternaria、镰刀菌属Fusarium、红酵母菌属Rhodotorula、炭疽菌属Colletotrichum、隐球菌属Cryptococcus和曲霉菌属Aspergillus等在烟草种子中丰度较高。FUNGuild功能预测结果显示,烟草种子内生真菌包括以下功能菌群：植物病原菌、动物病原菌、内生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌、土壤腐生菌、木材腐生菌等。烟草种子有丰富的内生真菌定殖,其中潜在的有益功能菌群包括镰刀菌、炭疽菌、隐球酵母菌、赤霉菌、曲霉菌等。     

应用16S rDNA克隆文库技术分析陈化烟叶细菌多样性

为较全面地分析陈化烟叶的细菌多样性,利用16S rDNA基因克隆文库技术分析了产自于福建的3个等级处于不同陈化阶段的12个烟叶样品中的细菌组成.采集C/S挑、B22、X21三个等级的陈化烤烟烟叶,陈化时间分别为3、6、12、24个月.实验结果表明,烤烟烟叶在陈化过程中共存在25种细菌,γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)细菌种类最丰富,含有19种细菌,α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)含有3种细菌,芽孢杆菌纲(Bacilli)含有2种细菌,β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)含有1种细菌.在12个烟叶样品中,肠杆菌属(Enterobacter)在8个样品中的比例最高,假单胞菌属(Pseudomonas)在2个样品中比例最高,泛菌属(Pantoea)和克洛诺菌属(Cronobacter spp.)分别在样品B6和C3中比例最高.在陈化过程中,烤烟叶面细菌组成没有明显的变化规律.     

PGPR菌剂对植烟土壤理化性状及phoD基因群落结构的影响

为探明PGPR菌剂对土壤磷素循环的微生物调控机制,以凉山州会理市的植烟田为研究对象,采集烤烟成熟期耕层土壤,通过化学分析和高通量测序技术,对细菌型、放线菌型和真菌型3种PGPR菌剂处理土壤的理化性质、磷酸酶活性及phoD基因群落组成进行了分析。结果表明,与常规施肥相比,施用3种PGPR菌剂均能显著提高土壤有机碳、全氮、有效磷和速效钾含量,放线菌型PGPR菌剂能显著提升土壤的磷酸酶活性。PGPR菌剂能提高植烟土壤phoD基因群落的多样性,门水平优势菌群为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和蓝菌门（Cyanobacteria）等,属水平优势菌属为链霉菌属（Streptomyces）、无枝酸菌属（Amycolatopsis）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等。冗余分析显示,速效钾、pH、速效磷等环境因子是影响植烟土壤phoD基因群落结构的主要因子。综上所述,PGPR菌剂能显著改善植烟土壤养分状况,提高土壤磷酸酶活性,改变烤烟耕层phoD基因群落结构。     

陈化烟叶中纤维素降解菌群的分离及其特性研究

从陈化烟叶中分离到具有降解纤维素活性的菌群,分析了温度、pH和纤维素材料对菌群酶活性的影响,采用16SrDNA片段的PCR-DGGE（变形梯度凝胶电泳）技术分析菌群组成。结果显示,菌群主要由5种细菌组成。20℃时菌群纤维素酶活性很低,随着温度升高酶活性升高,在60℃时纤维素酶活性达到最高值,继续升温则酶活性下降。pH从3升高到8时,菌群纤维素酶活性不断增大,pH为8时酶活性达到最大,pH继续升高到9时则酶活性下降。菌群对烟叶、滤纸和烟梗中的纤维素都有降解作用,在以烟叶作为纤维素材料培养菌群时,纤维素酶活性明显高于滤纸和烟梗。陈化过程中微生物可能对烟叶纤维素有降解作用,从而影响烟叶的陈化效果;可以利用分离到的菌群在烟叶或烟梗发酵中降解纤维素,改善烟叶或烟梗的品质。     

晒黄烟调制期叶面可培养细菌的多样性研究

以云南特色晒黄烟烟叶为供试样品, 对调制期三个部位烟叶定期取样, 研究叶面可培养细菌的动态变化和多样性。结果表明, 晒黄烟调制期叶面可培养细菌总量呈先升高后降低再略升高的趋势。细菌种群较为丰富, 主要分布在Bacillus 属、Pseudomonas 属、Arthrobacter 属和Exiguobacterium 属等10 个属。Bacillus 属菌株是整个调制期的优势细菌类群, 与烤烟烟叶的优势种群基本一致。      

云南不同产地醇化雪茄烟叶微生物群落差异研究

为探讨云南不同产地醇化雪茄烟叶的微生物群落结构与国外优质雪茄烟叶的差异,以6个不同产地的7组雪茄烟叶为试验材料,采用高通量DNA测序技术,对烟叶样品中的细菌、真菌群落进行了微生物组学分析。结果显示,样本中细菌群落丰富度高于真菌。根据主要菌群丰度的相似性特征,能够对不同产地的样本进行聚类。在细菌方面,云南德宏、玉溪的烟叶与巴西烟叶群落结构最接近,其共有且相对丰度较高的主要菌属为Staphylococcus、Atopostipes、Corynebacterium、Pseudomonas及Brevibacterium。在真菌方面,同样是玉溪、德宏与巴西、多米尼加的样本最接近,它们之间共有且丰度较高的类群是Aspergillaceae科的1个属、Alternaria属、Aspergillus属、Wallemia属以及Cladosporium属等。这些微生物可能对降解烟草中的大分子有机物起到积极作用。     

云南曲靖不同海拔烟区土壤和烟叶硼含量的分布状况及相关性

通过对云南曲靖烟区不同海拔植烟土壤有效硼和对应的烤烟硼含量的分析研究,得出该区土壤和烟叶中硼素分布的基本状况,在此基础上研究了土壤有效硼对烟叶硼含量的影响,并对不同海拔烟区的土壤有效硼含量和烟叶硼含量的分布特点进行了研究。结果表明:(1)曲靖植烟土壤有效硼平均含量基本处于适宜范围,平均为(0.46±0.25) mg/kg,但变幅较大(0.01～3.31 mg/kg);其中37.19%的土壤样本存在不同程度的缺硼(≤0.40 mg/kg)或硼含量偏高(＞1.0 mg/kg),该地区能够满足优质烟叶正常生长发育所需的土壤有效硼含量土壤占62.81％,其余土壤需对硼素进行适当调整;(2)曲靖烟区烟叶的硼含量平均为(24.06±11.09) mg/kg,变幅为3.22～66.44 mg/kg,有81.42％的烟叶样本硼含量在10.00～40.00 mg/kg范围内;(3)研究表明烟叶的硼含量与土壤有效硼含量间呈极显著正相关关系;(4)在曲靖地区土壤有效硼和烟叶硼含量均表现出随海拔高度降低而逐渐降低的变化趋势,特别是在1300～1500 m的海拔范围内表现得尤为明显。      

基于高通量测序的雪茄烟叶细菌多样性与功能预测

  背景和目的  环境条件与烟叶理化性质的改变直接影响烟叶的细菌群落结构和功能。为探究海南不同产区茄衣、茄套和茄芯细菌群落组成,研究雪茄烟叶细菌群落结构及代谢功能。  方法  以海南光村、昌江、白沙和五指山4个产区茄衣、茄套和茄芯为试验材料,基于16S rRNA测序技术分析细菌群落结构,PICRUSt预测分析细菌群落的代谢功能。  结果  12个样本中共聚类2317个OTU,属于10个科。五指山产区茄套的细菌群落丰富度及多样性最高,其Chao1指数、ACE指数和Shannon指数分别为344.00、344.00和6.54。光村和五指山产区细菌群落丰富度及多样性均表现为茄衣 < 茄套、茄芯。昌江产区则表现为茄衣 > 茄芯、茄套。茄衣的主要优势菌科为葡萄球菌科,相对丰度明显高于茄套、茄芯,不同产区之间无明显差异。茄套和茄芯的主要优势菌科为肠杆菌科,明显高于茄衣,且昌江、五指山 > 光村、白沙。KEGG代谢通路分析结果表明,不同产区茄衣、茄套和茄芯细菌预测功能种类差异较小,丰度差异较大。  结论  在科分类水平上,不同产区不同用途雪茄烟叶细菌群落多样性丰富,细菌群落结构组成相似,相对丰度有所差异,葡萄球菌科、肠杆菌科是造成烟叶细菌群落结构差异的关键菌科。细菌群落代谢途径丰富,主要富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢通路中,除此之外,也较多的富集在辅助因子以及维生素代谢等通路。      

曲靖烟区土壤化学性状及海拔对烟叶钾含量的影响

为分析曲靖市烟田土壤与烟叶钾含量的关系,调查了在垂直生态条件差异较大时,烤烟中部叶钾含量与土壤化学性状、海拔之间的关系。结果显示,曲靖市烟叶钾含量平均为1.51%,含量范围0.29%~3.01%,土壤有机质、碱解氮、速效钾、有效镁以及取样点海拔影响烟叶钾含量。土壤速效钾含量是影响曲靖市烟叶钾含量的最主要的因素,烟叶钾含量随土壤速效钾含量的增加而上升。土壤速效钾含量≤175.22 mg/kg或>276.010 mg/kg时,烟叶钾受土壤有效镁影响较大;速效钾含量在175.220~276.010 mg/kg时,土壤水溶性氯则成为烟叶钾的主要影响因素。海拔对烟叶钾含量影响分割点分别是1700、1822和2023 m,随高度增加,烟叶钾含量呈现逐步下降的趋势。