miRNA-188-5p表达下调通过调控PTEN/Akt途径抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力

【摘要】 目的 探讨miRNA-188-5p（miR-188-5p）在皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）组织和细胞中的表达，分析其表达下调对皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 2012年11月至2018年10月在河南省新乡医学院第一附属医院收集50例手术切除的皮肤鳞癌组织及50例癌旁正常皮肤组织。实时荧光定量PCR（qPCR）检测皮肤鳞癌组织、癌旁正常皮肤组织、皮肤鳞癌细胞系SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞中miR-188-5p的表达。培养的A431和HSC-5细胞分别分为2组：miR-188-5p抑制剂组和阴性对照组，对转染miR-188-5p抑制剂的细胞和阴性对照组细胞，通过qPCR检测miR-188-5p的相对表达（2-△△Ct），并以CCK8法和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖活性和侵袭能力。双荧光素酶报告实验检测miR-188-5p和PTEN的相互作用，Western印迹法检测PTEN、总Akt（t-Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）的表达。两独立样本比较采用t检验。结果 皮肤鳞癌组织中miR-188-5p的相对表达（5.213 ± 3.138）显著高于癌旁正常皮肤组织（1.010 ± 0.364，t = 9.187，P < 0.001）。SCL-1、A431和HSC-5细胞中miR-188-5p的表达（3.858 ± 0.163、7.068 ± 0.262和4.572 ± 0.413）均显著高于HaCaT细胞（1.079 ± 0.300，t = 17.890、21.110和8.737，均P < 0.05）。与阴性对照组相比，miR-188-5p抑制剂组A431和HSC-5细胞miR-188-5p表达显著下调（均P < 0.01），细胞增殖和侵袭能力下降（均P < 0.05）。双荧光素酶报告实验显示，miR-188-5p表达下调显著上调A431和HSC-5细胞中PTEN的表达，但抑制p-Akt的表达。结论 miR-188-5p在皮肤鳞癌组织和细胞中高表达，且miR-188-5p表达下调可能通过调控PTEN/Akt途径，抑制皮肤鳞癌细胞增殖活性和侵袭能力。     

微小RNA-373表达下调对皮肤鳞状细胞癌A431细胞周期和凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨微小RNA-373（miR-373）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）A431细胞周期和凋亡的影响。方法 将对数生长期A431细胞分为3组,miR-373抑制剂组和阴性对照组分别转染miR-373抑制剂和阴性对照miRNA,未处理组不做任何处理。转染后48 h,采用实时PCR检测各组miR-373的表达水平;采用CCK-8试剂分析miR-373表达下调对A431细胞增殖的影响,流式细胞仪检测不同处理组A431细胞周期分布和凋亡的变化,最后采用比色法检测各组胱天蛋白酶3（caspase-3）活性的变化。两组之间数据比较采用t检验,3组及以上采用单因素方差分析,两两组间比较采用LSD-t检验。结果 miR-373抑制剂组miR-373表达水平为0.120 ± 0.036,显著低于未处理组（1.002 ± 0.022）和阴性对照组（1.037 ± 0.028）,t值分别为36.21、34.83,均P < 0.001。miR-373抑制剂组在48、72和96 h细胞增殖活性均显著低于未处理组和阴性对照组,F值分别为10.805、13.720和30.907,P值分别为0.038、0.010和0.001）。miR-373抑制剂组G0/G1期比例为64.69% ± 1.18%,显著高于未处理组（52.74% ± 0.66%）和阴性对照组（53.80% ± 0.80%）,t值分别为15.51和13.24,均P < 0.001;总凋亡细胞比例为22.69% ± 1.24%,显著高于未处理组（9.62% ± 1.14%）和阴性对照组（9.66% ± 0.97%）,均P < 0.001;caspase-3活性为1.238 ± 0.057,显著高于未处理组（0.413 ± 0.028）和阴性对照组（0.437 ± 0.036）（均P < 0.001）。结论 miR-373可能在皮肤鳞癌细胞周期调控和凋亡诱导中发挥重要作用。     

miR-196-5 p靶向HOXA5激活JAK/STAT通路促进皮肤鳞状细胞癌的增殖、侵袭及EMT

 目的: 探讨miR-196-5p对皮肤鳞状细胞癌(CSCC)增殖、侵袭和EMT的影响及其潜在的作用机制。方法：利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-196-5p在癌旁正常组织、CSCC组织、A431细胞和HaCaT细胞中的表达水平。过表达或下调miR-196-5p在A431细胞中的表达后,通过CCK 8实验检测miR-196-5p对A431细胞增殖能力的影响;细胞侵袭实验检测miR-196-5p对A431细胞侵袭能力的影响;Western blot检测miR-196-5p对A431细胞内E-cadherin、N-cadherin表达的影响。生物信息学软件TargetScan预测miR-196-5p和HOXA5的作用位点,双荧光素酶报告基因实验分析miR-196-5p和HOXA5之间的关系。上调HOXA5在A431细胞内表达后检测其对A431细胞增殖、侵袭和EMT的影响。Western blot分析下调HOXA5对JAK/STAT通路的影响。AG490作用细胞后,分析下调HOXA5对A431细胞增殖、侵袭和EMT的影响。结果：与癌旁正常组织相比,CSCC组织中miR-196-5p表达水平明显升高（t=6.32,P=0.024）,HOXA5表达明显降低（t=7.60,P=0.017）。与HaCaT细胞相比,A431细胞中miR-196-5p表达明显升高（t=18.58,P=0.003）,HOXA5表达明显降低（t=19.72,P=0.003）。过表达miR-196-5p促进A431细胞增殖、侵袭与EMT,下调miR-196-5p则起到相反作用;miR-196-5p靶向且负调控HOXA5;过表达HOXA5抑制A431细胞增殖、侵袭与EMT;下调HOXA5激活细胞内JAK/STAT通路。AG490作用细胞后下调HOXA5对A431细胞增殖、侵袭与EMT的促进作用。结论：miR-196-5p靶向HOXA5激活JAK/STAT通路促进CSCC的增殖、侵袭和EMT。     

lncRNA UCA1通过激活miR-143/HK2通路促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、侵袭和EMT

 目的: 探讨长链非编码RNA UCA1 (lncRNA UCA1)在皮肤鳞状细胞癌A431细胞中的表达及其对A431细胞增殖、侵袭及其上皮间质转化（EMT）的影响。方法:通过RT-qPCR检测皮肤鳞状细胞癌、癌旁正常组织、A431细胞、HaCaT细胞中lncRNA UCA1的表达;siRNA技术下调lncRNA UCA1表达,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）、细胞侵袭实验和Western blot检测下调lncRNA UCA1对A431细胞增殖、侵袭和EMT的影响。通过生物信息学miRanda软件和双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA UCA1和微小RNA-143（miR-143）之间的关系。RT-qPCR检测miR-143在A431细胞、HaCaT细胞中的表达。同时上调lncRNA UCA1和miR-143表达,分析lncRNA UCA1通过miR-143对A431细胞增殖、侵袭和EMT的影响。通过生物信息学TargetScan软件和双荧光素酶报告基因实验检测miR-143与己糖激酶Ⅱ(HK2)之间的关系;RT-qPCR检测HK2在A431细胞、HaCaT细胞中的表达。siRNA技术下调HK2表达,分析A431细胞增殖、侵袭和EMT能力。结果：在A431细胞中lncRNA UCA1的表达上调（P<0.01）,miR-143表达下调（P<0.01）,HK2表达上调（P<0.01）。siRNA下调lncRNA UCA1表达明显抑制了A431细胞增殖、侵袭与EMT;lncRNA UCA1靶向且负调控miR-143;下调miR-143的表达促进A431细胞增殖、侵袭与EMT;上调lncRNA UCA1通过miR-143促进A431细胞增殖、侵袭与EMT。miR-143与HK2具有靶向关系。siRNA下调HK2表达抑制了A431细胞增殖、侵袭与EMT,lncRNA UCA1通过miR-143促进HK2表达。结论：lncRNA UCA1在皮肤鳞状细胞癌A431细胞中表达上调且通过miR-143/HK2轴促进A431细胞增殖、侵袭及其EMT。     

荷人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型中干扰血管内皮生长因子的实验研究

目的 在沉默血管内皮生长因子(VEGF)的荷人裸鼠皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)移植瘤中观察肿瘤生长,探讨靶向VEGF小发夹核酸(shRNA)的作用.方法 生物合成靶向人VEGF基因的shRNA干扰真核表达质粒(psilencer-VEGFl -shRNA、VEGF-s1;psilencer-VEGF2-shRNA、VEGF-s2),同时合成含随机靶序列的阴性对照表达质粒(psilencer-Target-off-shrank,T-off).将构建的质粒分别转染于筛选的人皮肤鳞癌细胞株(A431),获得稳转细胞株.实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应、双抗体夹心酶联免疫吸附法分别检测稳转细胞株中VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达.用稳转细胞株制备荷人皮肤鳞癌裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠体内肿瘤生长,6周后(20d)处死裸鼠进行肿瘤病理学研究,免疫组化染色检测瘤组织VEGF、增殖细胞核抗原( PCNA)和CD34蛋白的表达.应用stata 7.0统计学软件进行统计学处理.组间比较采用t检验.结果 转染VEGF-s1和VEGF-s2的A431细胞中VEGF mRNA表达分别为27.85±3.95和24.69±2.83,表达量显著低于未转染组(54.06±6.38,t值分别为6.05和7.29,P值均＜0.01);VEGF蛋白表达分别为32.67±2.52和29.27±1.10,亦显著低于未转染组(52.85±2.23,t值分别为8.04和11.53,P值均＜0.01).用转染VEGF-s1和VEGF-s2的A431细胞制备荷人皮肤鳞癌裸鼠移植瘤模型,裸鼠肿瘤体积分别为( 192.50±10.90) mm3和(203.67±3.21) mm3,明显小于未转染组(272.00±21.07 mm3,t值分别为5.80和5.55,P值均＜0.01);裸鼠肿瘤重量分别为(0.05±0.03)g和(0.13±0.04)g,与未转染组(0.25±0.02 g)比较明显减轻(t值分别为9.60和4.64,P值均＜0.01);裸鼠肿瘤细胞中VEGF蛋白表达率分别为52.00％±2.00％和56.67％±3.06％,PCNA阳性率分别为37.01％±2.41％和33.94％±3.25％,CD34阳性血管数分别为2.05±0.07和1.72±0.10,与未转染组(70.00％±2.00％、72.11％±3.02％和4.01±1.27)比较,均显著降低(P值均＜ 0.01).各项指标中,转染VEGF-s1和VEGF-s2组间、未转染组和T-off组间差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 靶向VEGF基因的shRNA能有效抑制A431细胞和荷人裸鼠皮肤鳞癌移植瘤中VEGF的表达,导致肿瘤生长受抑,肿瘤恶性表型减弱.     

翻译控制肿瘤蛋白在鳞状细胞癌和细胞株A431及SCL-1中的表达

目的 探讨翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)在人皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织及其细胞株A431及SCL-1中的表达,观察其对SCC细胞凋亡及增殖的影响.方法 免疫组化法观察TCTP蛋白在SCC组织中的表达.Western印迹法检测TCTP蛋白在SCC细胞株A431及SCL-1中的表达情况.继而构建针对编码TCTP的基因TPT1的siRNA序列,通过脂质体转染法转入A431细胞中,RT-PCR法检测TPT1的表达,Western印迹法检测TCTP蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法检测A431细胞增殖情况.结果 免疫组化结果显示,在SCC中存在着TCTP的高表达,且其表达水平与癌组织的分级有着正相关关系(P＜0.05).Western印迹结果证实,在A431细胞及SCL-1细胞株中都存在着TCTP的表达,以A431细胞表达为最高.荧光检测siRNA转染效率可达到90％ ～ 95％.RT-PCR及Western-Blot结果显示合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TPT1及TCTP的表达(P＜0.05).结论 合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TP及TCTP的表达,这种下调可引起A431细胞凋亡率的上升和细胞增殖的抑制.     

siRNA干扰Gadd45α表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞侵袭和迁移的影响北大核心CSCD

目的探讨靶向沉默生长抑制和DNA损伤诱导45蛋白α（Gadd45α）对皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞株A431侵袭和迁移的影响。方法采用实时荧光定量PCR、Western印迹检测A431和Colon16细胞Gadd45α基因和蛋白的表达,选取高表达Gadd45α的A431细胞株作为研究对象。将A431细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染Gadd45α-siRNA-1,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测干预后Gadd45αmRNA和蛋白的表达,Transwell小室法及细胞划痕法检测干预对A431细胞株侵袭及迁移能力的影响。结果A431细胞高表达Gadd45α基因和蛋白。干预后实验组A431细胞Gadd45αmRNA及蛋白相对表达量分别为0．286±0．013、0．33±0．007,明显低于阴性对照组组（1．028±0．183、0．87±0．002）以及空白对照组（1．001±0．057、0．86±0．004）,差异均有统计学意义（F值分别为5893．857、2763．000,均P〈0．001）。实验组A431细胞株穿过聚碳酸酯膜的细胞数为66．33±3．79,明显多于阴性对照组（26．00±4．36）和空白对照组（28．33±4．16）,3组间差异有统计学意义（F=20．084,P=0．002）。划痕实验中,实验组每高倍视野下细胞迁移数为315．33±6．66,明显多于阴性对照组（154．67±2．08）和空白对照组（130．67±3．51）,3组间差异有统计学意义（F=1676．255,P〈0．001）。结论A431细胞株高表达Gadd45α,靶向沉默Gadd45α表达能增强A431细胞株的侵袭和迁移能力。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

低分子肝素对A431细胞株生物学行为的干预研究

目的 研究低分子肝素对体外培养的皮肤鳞状细胞癌A431细胞株生物学行为的影响.方法 通过不同浓度的低分子肝素处理A431细胞,筛选出最佳实验浓度.用最佳浓度低分子肝素处理A431后,分别用细胞活力检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,用流式细胞仪检测细胞增殖;用划痕、Transwell小室和黏附试验分别检测A431细胞的迁移和黏附;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应、Western印迹和双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平,进行方差分析与t检验.结果 低分子肝素影响癌细胞活力的最佳浓度为200 IU/ml,用其处理A431细胞后,细胞活性降低,细胞周期阻滞,GI期细胞比率显著增加,S期细胞比率明显降低;低分子肝素组A431细胞增殖指数在48 h和72 h分别为23.41±5.51和11.76±5.13,均显著低于相应未处理组(分别为48.62±4.50和46.86±3.51,两组比较,t值分别为6.14和9.78,P值均＜0.05).低分子肝素组A431细胞中VEGF mRNA表达(48 h和72 h分别为10.16±0.07和4.11±0.01)显著少于相应未处理组(分别为18.77±0.11和17.39±0.05,两组比较,t值分别为114.38和451.10,P值均＜0.05),VEGF蛋白表达(分别为0.16±0.01和0.12±0.01)、VEGF分泌量(分别为67.17±3.34 ng/L和28.14±3.14 ng/L)亦显著少于相应未处理组(分别为0.20±0.01和0.21±0.01,122.63±23.17 ng/L和86.76±1.18 ng/L,P值均＜0.05).低分子肝素组A431细胞黏附率在48 h和72 h分别为29.7％±1.92％和17.5％±0.79％,均显著低于相应未处理组(分别为36.9％±0.35％和34.6％±0.96％,P值均＜0.05),并在24h、48 h和72 h后显著抑制了细胞迁移.结论 低分子肝素通过降低A431细胞活性、减少细胞VEGF表达,抑制A431细胞的增殖、迁移和黏附.     

Brahma相关基因1与激活转录因子2相互作用对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Brahma相关基因1(BRG1)在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)组织及细胞中的表达,及其与激活转录因子2(ATF2)相互作用调控cSCC细胞增殖、迁移、侵袭的分子机制。方法收集2015—2021年南通大学第二附属医院皮肤科经病理确诊为日光性角化病(AK)、cSCC(含原位鳞癌)患者的石蜡组织标本分别66例和80例,同时收集皮肤美容手术修整下的正常皮肤组织石蜡标本35例作为正常对照组。采用免疫组化染色法检测BRG1在cSCC、AK及正常皮肤组织中的表达,分析BRG1表达与cSCC患者临床病理参数之间的相关性。收集cSCC患者和健康对照新鲜组织标本各12例,常规培养cSCC细胞株A431和Scl-1及人永生化角质形成细胞株HaCaT,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织及细胞中BRG1 mRNA的表达,通过免疫共沉淀和细胞免疫荧光染色分析BRG1与ATF2的相互作用。通过RNA干扰法敲低A431、Scl-1细胞中BRG1(BRG1 siRNA1~5组)和ATF2表达(ATF2-shRNA组),并分别转染阴性对照siRNA或shNC作为对照(control siRNA组、shNC组),采用细胞计数(CCK8)实验、克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验分别检测敲低BRG1、ATF2对cSCC细胞增殖、迁移及侵袭的影响。多组间计量资料的比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用Dunnett-t检验。结果免疫组化染色显示,BRG1蛋白在cSCC、AK组织中的表达强度显著低于正常皮肤组织(χ^(2)=44.40,P<0.001)。qRT-PCR显示,cSCC组织中BRG1 mRNA表达水平(1.345±0.956)显著低于正常皮肤组织(2.499±1.501,t=2.25,P=0.035),A431、Scl-1细胞中BRG1 mRNA表达水平(0.041±0.002、0.026±0.003)亦显著低于HaCaT细胞(0.135±0.033,t=4.95、5.73,P=0.008、0.005)。BRG1的低表达与cSCC患者癌组织位于曝光部位(P=0.041)、肿瘤低分化程度(P=0.001)、Broder高分级(P<0.001)有关。BRG1 siRNA1组和BRG1 siRNA2组A431、Scl-1细胞克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数及细胞迁移率均显著高于control siRNA组(均P<0.05)。免疫共沉淀实验表明,在A431、Scl-1细胞中BRG1蛋白与ATF2蛋白能相互结合,免疫荧光法显示二者存在共定位;与control siRNA组相比,A431(BRG1 siRNA1、2组)和Scl-1细胞(BRG1 siRNA1组)中敲低BRG1表达可促进ATF2磷酸化激活(均P<0.05);与shNC组相比,shATF2组A431、Scl-1细胞克隆形成数(均P=0.001)、24~96 h细胞增殖活性(均P<0.001)、迁移细胞数及侵袭细胞数均显著降低(均P≤0.001)。结论BRG1在cSCC及AK组织中低表达,且BRG1可抑制cSCC细胞增殖、迁移及侵袭;ATF2促进cSCC细胞增殖、迁移及侵袭;BRG1可能通过与ATF2蛋白相互作用并抑制ATF2磷酸化激活,从而发挥抑癌作用。     

miRNA211在人皮肤黑素瘤的表达及功能研究

目的 探讨miRNA211（miR?211）在恶性黑素瘤进展过程中的表达以及靶分子MMP?16与miR?211表达的相关关系。方法 实验分阴性对照组、空载体对照组、miR?211过表达组。TaqMan荧光定量PCR检测miR?211在黑素细胞、黑素瘤细胞的表达,以及在痣、黑素瘤组织中的表达。SRB试验和流式细胞仪分别检测细胞增殖和细胞周期分布。甲基纤维素克隆形成试验和Transwell迁移试验研究细胞克隆形成和细胞迁移。用集落大小衡量克隆形成力,而同一迁移距离下的相对细胞数用来衡量细胞迁移能力。TaqMan荧光定量PCR检测比较miR?211表达增加前后MMP?16 mRNA表达的变化。结果 miR?211在黑素瘤细胞G361、C32和A375表达量分别是0.09 ± 0.02,0.000 52 ± 0.000 20,0.000 03 ± 0.000 01（F = 10410,P < 0.01）。miR?211在黑素瘤标本的表达量（0.17 ± 0.03）显著低于痣的表达量（0.87 ± 0.08）,t = 9.118,P < 0.01。在体外,miR?211表达上调的黑素瘤细胞miR?211过表达组与阴性对照组及空载体对照组比较,细胞增殖与细胞周期分布,差异无统计学意义。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.05、0.85 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 2.19,P < 0.05）。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.06、0.82 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 3.15,P < 0.05）。而空载体对照组与阴性对照组比较,差异无统计学意义。转染miR?211 mimics后24 h,在miR?211过表达组和空载体对照组的MMP?16 mRNA水平比较分别是0.33 ± 0.02和0.91 ± 0.03,两组比较,t = 11.30,P < 0.01;48 h分别是0.52 ± 0.01和0.96 ± 0.02,两组比较,t = 5.02,P < 0.05;72 h分别是0.71 ± 0.01和0.97 ± 0.03,两组比较,t = 3.85,P < 0.05。空载体对照组与阴性对照组在3个时间点的比较,差异均无统计学意义。结论 miR?211在恶性黑素瘤的细胞水平和组织水平低表达。miR?211抑制黑素瘤细胞的锚着非依赖性生长及细胞的迁移。miR?211表达上调后,MMP?16 mRNA表达下调,可能是miR?211下游的靶分子从而影响黑素瘤的侵袭转移。     

沉默信息调节因子1、3和缺氧诱导因子1α在皮肤鳞状细胞癌组织和细胞中的表达

目的:分析沉默信息调节因子1（Sirt1）、3（Sirt3）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）组织和细胞中的表达,探讨其在CSCC发生发展中的作用。方法:收集2019年1月至2020年12月就诊于宁夏医科大学总医院皮肤科、经病理活检确诊为高、中、低分化CSCC患者的病变组织和非癌症患者正常皮...     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

目的研究葡萄糖?6?磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞,采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%~90%融合时,将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞,未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达,CCK?8法检测3组A431细胞的增殖情况,流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019）,且A431细胞显著高于SCL?1细胞（均P<0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018）,差异均有统计学意义（P<0.05）。G6PD siRNA组在24~96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P<0.001）,而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P>0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）,而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。     

基于Wnt/β联蛋白信号通路探讨EphB2抑制剂对皮肤鳞状细胞癌的影响及作用机制

【摘要】 目的 采用分子对接法筛选酪氨酸蛋白激酶受体B2（EphB2）小分子抑制剂,研究其对皮肤鳞状细胞癌（CSCC）的影响及可能机制。方法 利用 Schrodinger对接工具预测EphB2蛋白的三维结构及其配体结合位点,通过分子对接进行高通量虚拟筛选EphB2抑制剂,通过体内外实验验证筛出的EphB2抑制剂山奈苷与芦荟大黄素（AE）抗CSCC的作用及机制。体外实验中,将人CSCC细胞系A431、SCL-1及人永生化表皮细胞HaCaT分别分为空白对照组、二甲基亚砜组、AE组与山奈苷组,通过MTT实验（AE浓度：20、40、80、160 μmol/L;山奈苷浓度：12.5、25、50、100 μmol/L）、划痕实验及Transwell小室实验（AE浓度：80 μmol/L,山奈苷浓度：50 μmol/L）分析EphB2抑制剂对CSCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。体内实验中,SPF级BALB/c雌性裸鼠皮下注射0.2 ml A431细胞悬液,待成功长出瘤体以后,随机分为4组（n = 6）,空白对照组、二甲基亚砜组、AE组（腹腔注射AE 20 mg·kg-1·d-1 AE）与山奈苷组（腹腔注射山奈苷25 mg·kg-1·d-1）;每周测量裸鼠的肿瘤大小和体重;连续给药28 d后,剥取裸鼠移植瘤进行HE染色,qRT-PCR与Western blot分析AE和山奈苷对裸鼠移植瘤中上皮钙黏着蛋白、波形蛋白、磷酸化葡萄糖合成激酶3β（p-GSK-3β）、β联蛋白及GSK-3β表达的影响。组间比较采用单因素方差分析及t检验。结果 筛选出对EphB2具有较高抑制活性的两个小分子化合物AA-504/20999031（山奈苷）和AA-466/21162055（AE）。MTT实验结果表明,与HaCaT细胞相比,AE对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随AE浓度升高毒性变强（F = 17.95,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为124.59 μmol/L和80.85 μmol/L;山奈苷对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随山奈苷浓度升高毒性变强（F = 11.34,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为119.64 μmol/L和64.96 μmol/L。划痕实验显示,与二甲基亚砜组细胞迁移距离（88.1±1.4） μm相比,AE组和山奈苷组A431细胞迁移距离［（36.7±1.0） μm和（44.7 ± 3.5） μm］显著缩短（F = 52.34,P < 0.001）,而HaCaT细胞迁移距离差异无统计学意义（F = 1.73,P = 0.238）。Transwell小室实验表明,与二甲基亚砜组A431细胞跨膜细胞数量（195.3 ± 5.7）相比,AE组和山奈苷组A431细胞显著抑制（145.0 ± 2.5和94.7 ± 4.1,F = 72.85,P < 0.001）,而对HaCaT细胞则无明显抑制作用（F = 3.91,P = 0.055）。动物实验表明,与二甲基亚砜组裸鼠移植瘤体积（841.88 ± 84.63） mm3相比,AE组和山奈苷组显著下降［（407.42 ± 70.37） mm3与（368.77 ± 62.7） mm3,F = 73.78,P < 0.001］。HE染色证实,AE和山奈苷干预可改善其病理变化。qRT-PCR与Western印迹结果显示,AE和山奈苷明显上调瘤体组织中上皮钙黏着蛋白与p-GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）,下调波形蛋白、β联蛋白及GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）。结论 分子对接筛选的小分子抑制剂与EphB2可形成稳定复合物,并通过影响 Wnt/β联蛋白通路诱导的上皮间质转化现象来抑制CSCC进程。     

MiRNA-203在寻常性银屑病皮损的表达及其对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究微小核糖核酸(miRNA)-203在寻常性银屑病患者皮损中的表达,并探讨对角质形成细胞株(HaCaT细胞)增殖的影响.方法 取2014-2016年23例寻常性银屑病患者的皮损组织和相邻非皮损组织.荧光定量PCR法检测组织中miRNA-203的表达水平,并以5'端、3'端地高辛标记的探针对皮肤组织切片中目的miRNA进行原位杂交,观察miRNA-203在皮肤组织中的定位情况.将miRNA-203模拟物(miRNA-203模拟物组)和miRNA-203模拟物阴性对照(阴性对照组)分别转染HaCaT细胞,正常细胞培养组作为空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Western印迹法分别对HaCaT细胞的增殖、细胞周期及相关周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin B1)的变化进行检测.结果 miRNA-203特异性地表达在表皮的角质形成细胞中,除细胞核外,细胞质亦有表达,且寻常性银屑病患者皮损组织中miRNA-203表达水平(1.35±0.28)显著高于非皮损组织(0.52±0.09),差异有统计学意义(t=6.76,P=0.012).转染miRNA-203模拟物能抑制HaCaT细胞增殖(F=9.36,P=0.007),且空白对照组、阴性对照组和miRNA-203模拟物组HaCaT细胞增殖率均随时间的延长逐渐增加(F=18.68,P＜0.001).与阴性对照组和空白对照组相比,miRNA-203模拟物组HaCaT细胞被阻滞在G2/M期(G2/M期细胞比例:31.33％±4.56％比17.02％±3.53％、16.67％±3.32％,均P＜0.05),HaCaT细胞周期蛋白周期蛋白D1表达水平较高(1.15±0.13比0.52±0.05、0.56±0.07,均P＜0.05),而周期蛋白B1水平较低(0.43±0.08比0.93±0.16、0.91±0.0.15,均P＜0.05).结论 miRNA-203可能参与了寻常性银屑病的发生发展过程.     

人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株电压门控钾通道的研究

目的 探讨电压门控钾通道在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞和人角质形成细胞HaCaT细胞中的作用.方法 噻唑蓝方法研究加入含有不同浓度四乙胺的培养基对A431细胞和HaCaT细胞的增殖的影响;提取体外培养A431细胞、HaCaT细胞以及人正常表皮组织的蛋白,ELISA方法检测电压门控钾通道蛋白(HERG)在它们中的表达,比较它们的差异.结果 四乙胺对体外培养的A431细胞和HaCaT细胞的增殖抑制效应具有时间依赖与剂量依赖的特点,当四乙胺的浓度≥10 mmol/L且作用时间≥24 h,可以使A431细胞和HaCaT细胞的增殖受到明显的抑制.HERG钾通道蛋白在A431细胞、HaCaT细胞和人正常皮肤表皮组织均有表达,平均浓度分别为(49.7114±3.55696)pg/ml、(35.7471±4.14696)pg/ml、(36.8857±3.47810)pg/ml,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 阻断电压门控钾通道可抑制A431细胞和HaCaT细胞的增殖;电压门控钾通道可能在人皮肤鳞状细胞癌细胞上的表达更显著.

Abstract：

Objective To investigate the role of voltage-gated potassium channel in the human skin squamous cell carcinoma A431 cells and human keratinocyte HaCaT cells. Methods MTT assay was performed to detect the effect of different concentrations of tetraethylammonium (TEA) on the proliferation of cultured A431 cells and HaCaT cells. Besides, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted to detect the expression of HERG channel protein in A431 cells, HaCaT cells and normal human skin tissue.Results TEA inhibited the proliferation of A431 cells and HaCaT cells in a dose- and time-dependent manner.After treated with TEA (≥ 10 mmol/L) for 24 or more hours, the proliferation of A431 cells and HaCaT cells was obviously suppressed. A significant difference was observed in the average concentration of HERG channel protein between A431 cells, HaCaT cells and normal human skin tissue (49.7114 ± 3.55696 pg/ml, 35.7471 ±4.14696 pg/ml, 36.8857 ± 3.47810 pg/ml, all P < 0.05). Conclusions The block of voltage-gated potassium channel could inhibit the proliferation of A431 cells and HaCaT cells, and the expression of voltage-gated potassium channel seems to be higher in human skin squamous cell carcinoma cells.     

土贝母苷甲通过调控circ_0000376/miR-203轴影响皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞恶性表型

 目的:探讨土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞恶性表型的影响及可能机制。方法：将体外SCL-1细胞分为对照组、不同剂量（5、10、20 μg/mL）土贝母苷甲组、si-NC组、si-circ_0000376组、土贝母苷甲+pcDNA组和土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Transwell检测细胞迁移和侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表达,RT-qPCR检测circ_0000376和miR-203表达。双荧光素酶报告基因实验验证circ_0000376和miR-203调控关系。对照组与不同剂量土贝母苷甲组各检测指标比较用单因素方差分析;si-NC组与si-circ_0000376及土贝母苷甲+pcDNA组与土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组各检测指标比较行独立样本t检验。结果： 与对照组比较,土贝母苷甲组SCL-1细胞增殖抑制率、凋亡率及Bax蛋白表达升高（F值分别为772.61、352.20、277.56,P值均<0.01）,细胞迁移数、侵袭数及Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表达降低（F值分别为125.57、180.50、257.87、301.22、399.27、233.29,P值均<0.01）,circ_0000376表达降低（F=205.36,P<0.01）,miR-203表达升高（F=247.14,P<0.01）,且呈剂量依赖性。与si-NC组比较,si-circ_0000376组SCL-1细胞增殖抑制率、凋亡率及Bax蛋白表达升高（t值分别为36.78、21.56、25.20,P值均<0.01）,细胞迁移数、侵袭数及Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表达降低（t值分别为16.00、17.79、21.73、21.02、21.62、19.68,P值均<0.01）。双荧光素酶报告基因实验结果显示,circ_0000376靶向负调控miR-203。与土贝母苷甲+pcDNA组比较,土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组SCL-1细胞增殖抑制率、凋亡率及Bax蛋白表达降低（t值分别为35.31、19.65、19.55,P值均<0.01）,细胞迁移数、侵袭数及Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表达升高（t值分别为12.27、21.37、24.15、23.40、23.48、22.28,P值均<0.01）。结论： 土贝母苷甲可能通过调控circ_0000376/miR-203轴抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。