小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。     

新鲜与短期培养胰岛细胞移植对移植胰岛存活的影响

目的 观察新鲜和短期培养后的小鼠胰岛细胞对移植后胰岛的再血管化及功能的影响.方法 C57小鼠作为胰腺供体,胆总管灌注胶原酶P溶液消化胰腺,Ficoll 400不连续梯度纯化获得胰岛细胞.接受不同胰岛细胞肾被膜下移植的受体糖尿病C57小鼠随机分成三组(n=10):A组接受新鲜胰岛细胞移植,B、C组分别接受培养1、3d的胰岛细胞移植.术后观察血糖变化并于移植后第14天取移植胰岛,分别进行HE染色和胰岛素、CD31免疫组织化学染色,并计算微血管密度.结果 胰岛细胞移植后3d内,三组小鼠的随机血糖浓度均＜11.0 mmol/L.A组小鼠在移植后第14天时的血糖浓度仍＜11.0 mmol/L,而B、C组小鼠血糖浓度在移植3d后呈现持续上升,此后各时间点的血糖浓度均显著高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学胰岛素染色结果显示:A组小鼠肾被膜下成团的细胞被染成棕褐色,B、C组类似细胞团仅有少量着色.免疫组织化学CD31染色发现,A组小鼠肾被膜下移植细胞团内部有大量细胞胞质被染成棕黄色,而B组和C组仅有少量细胞着色;A组肾被膜下胰岛内微血管密度显著高于B、C组(P＜0.05).结论 小鼠新鲜胰岛细胞移植较短期培养后胰岛细胞移植更有利于移植胰岛的再血管化及存活.     

同种异体胰岛细胞移植在糖尿病小鼠中的实验研究

目的 通过建立糖尿病小鼠模型,观察同种小鼠胰岛细胞移植前后血糖、胰岛功能的变化,探索胰岛细胞分离、纯化、移植的方法及有效性.方法 采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制糖尿病小鼠模型,经胆囊注入V型胶原酶水浴消化胰腺并进行密度梯度离心以分离纯化胰岛细胞,并在消化液和Ficoll分离液中加入了大豆胰酶抑制剂(STI)和牛血清白蛋白组份V(BSA),用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,锥虫蓝排斥试验评估胰岛存活率;糖尿病小鼠行同种异体胰岛细胞移植后,检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,以判定胰岛功能.结果 糖尿病小鼠模型胰腺形态有明显病理变化,同种小鼠胰岛纯化后细胞形态完好,使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的(40.7±13.2)个提高到了(263.5±32.I)个(P<0.01),活性在95%以上,胰岛移植后,实验组48 h后血糖明显下降,C肽水平上升.结论 采用加用STI、BSA小鼠胰岛细胞分离纯化方法可增加胰岛细胞产量,同种小鼠胰岛细胞移植能明显降低糖尿病小鼠血糖水平,改善胰岛功能,从而达到治疗目的 .     

不同途径骨髓基质干细胞移植治疗小鼠糖尿病效果

目的研究不同途径骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对小鼠糖尿病治疗效果。方法分离骨髓,贴壁培养并纯化和扩增BMSCs。腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病动物模型。取2×105个第3代BMSCs,对模型鼠分别进行胰腺内多点注射、尾静脉移植以及肾被膜移植。动态观察移植后小鼠的血糖、体质量及行为的变化。结果与糖尿病对照组相比,胰腺移植组、尾静脉移植组和肾被膜移植组小鼠的糖尿病症状有所改善,血糖明显降低(F=32.58~48.35,q=10.06~14.98,P<0.05),以胰腺移植组血糖下降更为显著。结论 3种途径BMSCs移植对小鼠糖尿病均有治疗作用。     

T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

供体凋亡细胞输注对大鼠胰岛移植物功能的影响

目的 研究供体凋亡细胞预输注对大鼠胰岛移植后胰岛移植物功能的影响.方法 应用STZ制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.经阴茎背静脉输注供体凋亡脾细胞,7d后于糖尿病SD大鼠双侧肾包囊进行同种异体胰岛移植,通过测定血糖变化、血清胰岛素水平以及胰岛移植物存活时间来观察胰岛移植物的功能状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位生存时间达31 d),并较长时间地维持受体鼠血清胰岛素处于较高水平.结论供体凋亡细胞预输注能够显著延长同种异体胰岛移植物的存活时间,能够较长时间维持胰岛移植物的正常功能状态.     

鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植

目的：观察大鼠同种异体肾上腺细胞肾被膜下移植治疗肾上腺皮质功能不全的可行性,并提供一种有效的移植途径。方法：成年雄性Wistar大鼠40只,分为对照组（双侧肾上腺切除术）,实验组（双侧肾上腺切除＋肾被膜下细胞移植术）,假手术组（仅暴露肾脏后关闭切口）,观察大鼠体内皮质酮、醛固酮激素质量浓度的动态变化及局部新生组织的血管生长和淋巴、巨噬细胞的浸润情况。结果：移植的肾上腺细胞可存活并能部分替代大鼠分泌皮质酮、醛固酮的功能。术后6周局部可见血管长入,无明显炎性细胞浸润。结论：植入肾被膜下的肾上腺细胞能存活并有分泌功能,且肾被膜下移植为肾上腺细胞提供良好的移植床。     

同种异体胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的护理

目的：总结同种异体胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的护理研究。方法按JDRF标准筛选3例1型糖尿病患者(T1DM),并实施同种异体胰岛细胞移植。在GMP实验室内以Liberase 酶消化胰腺器官、COBE 2991细胞分离机分离、连续密度梯度纯化,获取高纯度与高活性的胰岛细胞。培养12h后,检测其达到移植标准,再经皮穿刺肝脏门静脉主干,经门静脉将胰岛细胞匀速移植到肝脏内。术后应用各种护理方法,密切观察病情变化和各种并发症的变化。结果2例完全脱离胰岛素治疗,1例胰岛素用量较术前减少60%以上。术后血糖稳定,C肽、糖化血红蛋白在正常范围,肾功能得以改善,无移植并发症、以及低血糖发作,患者掌握了术后自我管理的方法,总结出了个体化的护理经验。结论患者护理效果满意,初步建立同种异体胰岛细胞移植治疗1型糖尿病一整套护理方法。     

移植部位对移植胰岛长期存活的影响

目的 观察移植部位对糖尿病小鼠移植胰岛长期存活的影响.方法 采用胶原酶P溶液胰管灌注和Ficoll-400不连续密度梯度纯化法获取供体小鼠胰岛.受体糖尿病小鼠分别接受同基因和异基因肾被膜下、小网膜囊和腋窝胰岛移植,监测受体移植后的血糖变化;根据血糖情况取移植胰岛排斥标本,观察不同部位移植胰岛的组织学变化.结果 成功分离、纯化供体小鼠胰岛,纯度为( 94±5)％或(90±5)％,存活率为(92±3)％.胰岛移植后均能使受体小鼠高血糖逆转至正常.同基因或异基因胰岛移植短期存活状态:肾被膜组与小网膜囊组的血糖降低值比较差异无统计学意义(P＞0.05),移植后肾被膜组血糖值显著低于小网膜囊组(P＜0.05);腋窝组血糖降低值和血糖值与肾被膜组和小网膜囊组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).同基因或异基因胰岛移植长期存活状态:肾被膜组与小网膜囊组血糖降低值比较差异有统计学意义(P＜0.05),且肾被膜组血糖值较低,移植胰岛存活率较高;腋窝组移植胰岛不能达到长期存活;在同一部位,同基因与异基因胰岛移植受体的血糖降低值比较,差异有统计学意义(P＜0.05).组织学检查发现:肾被膜组和小网膜组胰岛完整,有少量炎症细胞浸润;腋窝组胰岛细胞被破坏,大量炎症细胞浸润.结论 肾被膜下胰岛移植降血糖效果迅速、稳定,能达到长期存活的目的,可视为胰岛移植的理想部位.     

FK506对糖尿病小鼠胰岛移植物功能及再血管化的影响

目的探讨小鼠胰岛移植术后服用他克莫司（FK506）对胰岛移植物生物学功能及再血管化的影响。方法小鼠胰腺经胶原酶P灌注消化后,Ficoll．400不连续密度梯度离心提纯并培养制备供体胰岛。1型糖尿病受体小鼠接受肾被膜下胰岛移植并分成两组：单纯同系基因胰岛移植组（PIT组）和同系基因胰岛移植后加用FK506组（PIT＋FK506组）。监测受体小鼠血糖浓度的变化,观察移植物组织学形态、胰岛素分泌功能及新生血管生成情况。结果两组小鼠各时间点血糖浓度的变化差异无统计学意义（P〉0．05）。组织形态学观察发现两组小鼠胰岛移植物均存活良好,无明显差别。移植后第3～5天和第20天,PIT＋FK506组移植物血管内皮生长因子（VEGF）和CD34表达均较PIT组有所降低;PIT组肾被膜下移植物微血管密度分别为16．6±1．3和96．7±2．3,PIT＋FK506组分别为9．3±1．0和61．0±2．7,相同时间点两组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论治疗剂量的FK506可在一定程度上抑制胰岛移植物的再血管化,但不会直接影响胰岛细胞的生物学功能。     

一种简易高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的 探索一种简便高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法 摘取四只BALB/c小鼠的胰腺,0.25mmPenfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病C57小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果 纯化后共得到（789.6±26.4）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（77.12±3.23）％;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍（P<0.01）。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达（16.3±2.9d）。结论 提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

胰岛细胞多肽激素分泌颗粒释放形式及其转运意义的透射电镜观察

目的观察胰岛的超微结构特点,探讨胰岛细胞多肽激素分泌颗粒的释放形式和转运途径及其功能意义。方法对小鼠胰组织超薄切片,进行透射电镜观察。结果小鼠胰岛散在分布于胰腺小叶之间,主要由A、B两类内分泌细胞组成。胰岛内部和周围存在丰富的有孔型（50nm）毛细血管;毛细淋巴管内皮为开放连接型（0．5～1．5μm）,只存在于胰岛周围。胰岛细胞内含大量电子致密的分泌颗粒（200～500nm）,常见许多分泌颗粒靠近细胞膜或突出于细胞表面。在胰岛细胞周围的组织间隙内,也常见到与胰岛细胞内相似的分泌颗粒。结论小鼠胰岛细胞多肽激素分泌颗粒连同颗粒被膜整体释放;释放入胰组织液中的多肽激素或分泌颗粒,更易通过淋巴管随淋巴转运,间接进入血液循环而发挥作用。     

Activated pancreatic stellate cells can impair pancreatic islet function in mice

Background

Pancreatic or islet fibrosis is often associated with activated pancreatic stellate cells (PSCs). PSCs are considered not only to promote fibrosis, but also to be associated with glucose intolerance in some diseases. We therefore evaluated morphological and functional relationships between islets and PSCs in the normal mouse pancreas and transplanted islets.

Methods

Immunohistochemistry was used to map the presence of PSCs in the normal mouse pancreas and islets implanted under the renal capsule. We isolated and cultured mouse PSCs and characterized them morphologically by immunofluorescence staining. Furthermore, we measured their cytokine production and determined their effects on insulin release from simultaneously cultured islets.

Results

PSCs were scattered throughout the pancreas, with occasional cells within the islets, particularly in the islet capsule. In islet transplants they were found mainly in the graft periphery. Cultured PSCs became functionally activated and produced several cytokines. Throughout the culture period they linearly increased their production of interleukin-6 and mammalian keratinocyte-derived chemokine. PSC cytokine production was not affected by acute hyperglycemia. Syngeneic islets co-cultured with PSCs for 24–48 h increased their insulin release and lowered their insulin content. However, short-term insulin release in batch-type incubations was unaffected after 48 h of co-culture. Increased islet cell caspase-3 activation and a decreased islet cell replication were consistently observed after co-culture for 2 or 7 days.

Conclusion

Activated PSCs may contribute to impaired islet endocrine function seen in exocrine pancreatitis and in islet fibrosis associated with some cases of type 2 diabetes.     

人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗NOD/SCID糖尿病小鼠

目的 探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID）小鼠的可行性.方法 体外分4阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞：①诱导分化形成定型内胚层;②诱导胰腺细胞定向分化;③扩增胰腺前体细胞;④促进胰岛细胞成熟.观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）、胰高糖素（glucagon）、胰岛素（insulin）、C肽（C-peptide）、葡萄糖转运子2（Glut-2）的表达.3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入链脲菌素（streptozotocin,STZ）诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果 hESCs诱导4阶段细胞表达胰高血糖素、胰岛素、Glut-2;共表达PDX-1和C肽;流式鉴定诱导4阶段胰岛素阳性细胞为17.1％;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应;3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入NOD/SCID 糖尿病小鼠体内可逆转其高血糖至少12周.结论 体外定向诱导hESCs分化形成的胰腺前体细胞及胰岛细胞分别植入NOD/SCID小鼠可逆转其高血糖.     

Nerve cells in transplanted pancreatic islets: no effects of cyclosporin or tacrolimus on immediate neuronal survival

Previous experiments have demonstrated that neuronal cells within pancreatic islets survive the isolation procedure and constitute an integral part of transplanted pancreatic islets. The aim of the present study was to investigate to what extent immunosuppressive drugs affects the acute survival of intra-islet neurons after pancreatic islet transplantation. For this purpose, C57BL/6 mice were syngeneically transplanted with 250 islets under the renal capsule. The animals were treated for 7 consecutive days with subcutaneous injections of cyclosporin, tacrolimus or vehicle. After this, the animals were killed and the grafts were removed, fixed and stained for the presence of the neuron-specific protein PGP 9.5. The number of nerves were then morphologically quantitated. No differences between the experimental groups were seen, and the number of nervous elements were approximately 5 per mm2 in all animals. It is concluded that immunosuppressive treatment does not affect the acute survival of graft neurons after experimental islet transplantation.     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞（BMSC）移植对糖尿病大鼠的作用。方法：通过贴壁法分离培养同种异体SD大鼠的BMSC,应用重组腺病毒-绿色荧光蛋白（Ad-GFP）病毒感染传2代的BMSC,并经筛选获得稳定表达GFP的BMSC用于移植。将链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠（血糖≥16．7mmol/L）随机分为实验对照组[（22．27±2．23）mmol／L,n=6）和移植组[（2218±194）mmol／L,n=9）]。移植组大鼠尾静脉注射BMSC悬液04ml,细胞数lxlO^6xlO^7／ml;在实验对照组及造模前随机抽取的5只正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水。移植2周后采血测各组血糖、糖化血红蛋白（HbAc）、胰岛素,并处死大鼠剖取胰腺,制作石蜡切片进行胰岛素免疫组化及冰冻切片荧光倒置显微镜直接观察GFP表达。结果：实验2周,实验对照组糖尿病大鼠血糖[（27．96±1．87）mmol／L,n=6）]、HbAlc（22．51±2．99,n=6）明显高于正常对照组[（7．97±1.00）mmol／L;（9．15±0．82,n=5）],胰岛素[（11．57±3．25）mU／L,n=6）]明显低于正常对照组[（33．68±6．21）mUL,n=5）]（P〈0．001）。移植组血糖[（23．63±6．42）mmol／L,n=9）]、HbA1c（18．26±3．96,n=9）低于实验对照组（尸〈O．05）,胰岛素[（13．89±7．89）mU／L,n=9）1高于实验对照组（尸〉0．05）。免疫组化结果显示,实验对照组胰岛及胰岛中心细胞数明显减少。胰岛素反应基本阴性。仅见个别胰岛细胞内出现少量微弱淡黄色的细颗粒。移植组大鼠胰岛中心部细胞增多,大部分胰岛素反应阳性或强阳性呈黄色或褐色颗粒。胰腺外分泌组织可见表达EGFP的细胞,胰岛中未发现其表达。结论：糖尿病大鼠经同种异体BMSC移植后,血糖、HbA,c均下降,胰岛素水平升高,可能通过内源性胰岛细胞增生发挥治疗作用。