神经干细胞在wistar大鼠体内、外追踪胶质瘤细胞的特性

目的 观察在胶质瘤细胞存在这一病理状态下,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在体内、外的迁移特点;了解导入NSCs的外源基因在迁移过程中的表达情况。方法 分离、培养NSCs,脂质体介导pIRES2-EGFP质粒转染NSCs,BrdU标记NSCs;共同培养胶质瘤细胞和NSCs,观察NSCs在体外的迁移特点;制作大鼠颅内胶质瘤模型,用转染EGFP基因和BrdU标记的NSCs接种颅内胶质瘤,免疫组织化学检测,观察NSCs在体内的迁移特点,了解导入NSCs的外源基因在颅内的表达情况。结果 培养成功了Wistar胎鼠大脑NSCs,成功将EGFP基因导入NSCs,NSCs在体内、外显示了对胶质瘤细胞强烈的追踪特性,同时表达外源基因的产物。结论 NSCs在体内、外具有追踪胶质瘤细胞的特性,同时能够表达外源基因的产物。     

体外培养及冻存对大鼠胚胎神经干细胞生物学特性的影响

目的体外培养、冻存、移植大鼠胚胎神经干细胞（NSCs），观察细胞生物学特性有无改变。方法取孕15d的大鼠海马区细胞，体外培养；以20％牛血清白蛋白（BSA）加10％二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护剂，于液氮中冻存；复苏后计数活细胞数，免疫细胞化学鉴定其分化状态；移植入C6大鼠胶质瘤模型观察其存活情况。结果第1-4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40％-63％之间，差异无显著性意义。冻存复苏后的NSCs能够增殖、传代，移植入胶质瘤模型体内能够大量存活。结论大鼠胚胎NSCs能够在体外增殖、分化。并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

BALB/c小鼠C6脑胶质瘤模型的建立及生长特性观察

目的建立BALB/c小鼠C6脑胶质瘤模型,观察其生长特性.方法将体外培养的细胞数为1×103,1×104,5×104个分别悬浮于无血清DMEM培养液10μl中的C6胶质瘤细胞接种于BALB/c小鼠左顶枕区,观察不同C6细胞浓度实验鼠的生存状态及肿瘤生成率.对自然死亡荷瘤鼠行组织病理学和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学检查.另外,在实验3 d、6 d、9 d、12 d、15d、20 d时解剖实验鼠,对肿瘤体积进行统计测量.结果该方法建立的胶质瘤动物模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤,且颅内生长稳定.3组成瘤率分别为65%、75%、80%.未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性较好.结论BALB/c小鼠C6脑胶质瘤模型的肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型.     

三种鼠脑胶质瘤模型的建立与比较

目的 ;建立GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠、C6胶质瘤细胞SD大鼠及BALB/c小鼠皮下动物模型,比较其肿瘤生长特点。方法借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261、大鼠C6胶质瘤细胞分别接种于C57BL/6小鼠及SD大鼠右侧尾状核区,C6胶质瘤细胞接种于BALB/c小鼠左前肢皮下。接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,颅内模型于接种后7d、14d、21d、28d进行MRI检查,皮下模型测量体积,并绘制生长曲线。解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋(GFAP)免疫组化检查。结果 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型较之后两种模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤,而且颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好。结论 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。     

神经干细胞移植对大鼠视神经损伤后节细胞的保护作用

目的探讨神经干细胞（NSCs）移植对视神经受损SD大鼠视网膜节细胞（RGCs）的保护作用。方法将48只健康成年SD大鼠随机分为N组（NSCs移植组）和C组（对照组），均使用精确校准方法在右眼造成部分视神经损伤，左眼作为正常对照。从胚胎SD大鼠海马分离NSCs。利用细胞培养和体内移植技术。将培养后的NSCs注入N组大鼠右眼玻璃体内，C组大鼠右眼玻璃体内注入同等体积的PBS。处死前3d在双上丘注射3％快蓝逆行标记双眼RGCs。将大鼠分别于注射NSCs或PBS后7d、14d、21d、28d处死，各分为4组。每组6只。分离视网膜置于荧光显微镜下，摄影输入计算机图像分析仪计数RGC。计算RGC标识率。另取6只健康成年SD大鼠作NSCs移植，分别于移植后7d、28d处死，每时间段3只。通过视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜的存活、整合情况。结果N组大鼠各时间段RGCs标识率与C组同时间段比较均增高，有显著性差异（P〈0．01）；N组与C组RGCs标识率均随时间延长而降低。且前后段时间比较有显著性差异，但N组降低速度明显慢于C组。NSCs移植7d后部分移植细胞迁移进入视网膜的内网层和节细胞层。28d后可见移植细胞广泛整合至宿主视网膜内。结论NSCs移植入视神经损伤大鼠视网膜后可提高视网膜神经节细胞的存活率．对受损的节细胞具有一定的保护作用。     

神经干细胞对脑肿瘤干细胞体内外趋向性研究

目的 探讨人神经干细胞(hNSCs)对脑肿瘤干细胞(BTSCs)的趋向性.方法 利用神经球培养方法培养胶质母细胞瘤(GBM)来源的BTSCs.采用Transwell细胞迁移实验检测hNSCs对BTSCs的体外趋向性;利用立体定向注射的方法,建立裸鼠颅内AAV-EGFP-BTSCs移植瘤模型,将标记有红色荧光蛋白(RFP)的人源性NSCs(hNSCs)接种到移植瘤对侧脑组织,荧光显微镜观察hNSCs向移植瘤的迁移情况及在移植瘤体内的分布.结果 GBM组织中可分离扩增到CD133+和Nestin+的BTSCs细胞,BTSCs在体外以神经球的形式生长,将这些细胞接种到裸鼠颅内可形成新的胶质瘤.细胞迁移实验显示体外培养的hNSCs可向BTSCs定向迁移,裸鼠颅内移植瘤实验显示hNSCs可在颅内沿切线向BTSCs移植瘤定向迁移,并能穿透肿瘤组织,到达瘤组织中心区.结论 外源hNSCs对BTSCs具有明确的体内外趋向性.这一特性可被用于干细胞为载体的基因治疗研究.     

骨髓间充质干细胞源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性。方法阿尔法最低必需培养基(α-MEM)、神经细胞生长添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导BMSCs向神经细胞分化。体外通过Transwell系统共培养BMSCs源性神经细胞与C6胶质瘤细胞培养基,HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量;体内在C6胶质瘤模型中移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs源性神经细胞,免疫组化分析移植细胞的迁移能力。结果条件培养基诱导BMSCs分化的细胞表达神经元核抗原(NeuN)为47%±0.08%,高分子量神经丝蛋白(NF-H)为45%±0.07%及部分巢蛋白(Nestin)为10%±0.04%,体外Transwell结果显示BMSCs源性神经细胞透过聚碳酸酯膜微孔的数量明显高于对照组(P<0.05),体内移植结果显示BMSCs源性神经细胞与BMSCs对胶质瘤的迁移无明显差异(P>0.05)并呈现时间特异性(P<0.01)。结论 BMSCs源性神经细胞对C6胶质瘤有明显的趋向性。     

颅内胶质瘤模型建立及肿瘤生长特征观察

目的建立Wistar、SD大鼠及BALB/c小鼠脑胶质瘤动物模型,比较其颅内肿瘤生长特点.方法借助动物立体定向仪,将体外培养大鼠C6胶质瘤细胞(细胞数为3×105个,悬浮于无血清DMEM培养液60 μl中)分别接种于Wistar、SD大鼠左侧尾状核区, BALB/c小鼠左顶枕区(接种细胞数为1×103).接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,分别于接种后5、15 d进行MRl检查.在实验3 d、6 d、9 d、12 d、15 d时解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化检查.结果两种大鼠脑胶质瘤动物模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤.而且具有颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好.而BALB/c小鼠成瘤率76.67%.结论接种的Wistar、SD两种大鼠脑胶质瘤动物模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似.均可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型.而BALB/c小鼠则需进一步探索.     

超顺磁性氧化铁标记神经干细胞移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习记忆的影响

目的 探讨以超顺磁性氧化铁（SPIO）标记的胎鼠神经干细胞（NSCs）移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习与记忆的影响。方法 体外培养的胎鼠NSCs用Fe2O3-多聚左旋赖氨酸（Fe2O3-PLL）标记，普鲁士蓝和台盼蓝染色分别检测标记率和细胞活力。将大鼠随机分为A组（正常对照组）、B组（正常标记NSCs移植组）、C组（脑缺血组）、D组（标记NSCs移植组）、E组（未标记NSCs移植组）及F组（灭活标记NSCs移植组）。取C组、D组、E组和F组大鼠制备局灶性脑缺血模型；将标记及未标记的NSCs悬液及灭活的标记NSCs悬液分别定向注射于B组、D组、E组和F组大鼠左侧纹状体内；移植后3d、7d、2周、3周、4周，对A组、C组、D组和E组分别进行Y型电迷宫检测；对B组、D组和F组进行活体MRI示踪扫描；MRI扫描后的大鼠行脑组织切片普鲁士蓝染色，观察移植的NSCs分布。结果NSCs的FeO3-PLL标记率近100％，标记的NSCs细胞活力为95％。与C组比较，D组和E组移植后各时间点大鼠的学习与记忆能力明显改善（均P〈0.05）；MRI显示移植4周后D组移植区低信号影范围较大；脑组织切片可见移植的NSCs沿胼胝体向对侧迁移。结论 Fe2O3-PLL标记不影响NSCs活力；移植NSCs能改善脑缺血大鼠的学习与记忆功能；移植的NSCs可向病灶区迁移。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经细胞在体外 对C6胶质瘤细胞的趋向性

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞的趋向性。方法首先采用梯度离心分离BMSCs,在条件培养基中添加合适诱导因子诱导BMSCs分化为神经细胞,分化后的细胞进行免疫荧光细胞化学分析后与C6胶质瘤细胞采用Transwell培养板共培养,最后对迁移的细胞做统计学分析。结果 BMSC成功诱导分化为神经细胞Nestin(24.3±5.2)%、NSE(33.6±3.8)%和NeuN(41.9±4.7)%,共培养实验显示实验组迁移细胞明显多于对照组迁移细胞(p<0.05)。结论大鼠骨髓间充质干细胞分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞具有明显趋向性。     

骨髓基质干细胞向大鼠脑胶质瘤的趋向迁移作用

目的 研究骨髓基质干细胞(BMSCs)向大鼠脑胶质瘤的趋向性.方法 在体外分离培养Fisher344大鼠BMSCs.流式细胞仪检测细胞免疫表型;Transwell法分别将BMSCs、NIH3T3细胞与9L细胞进行共培养.24 h后计算细胞迁移率:立体定向法建立Fisher344大鼠/9L细胞脑胶质瘤模型,2周后经神经行为学、MRI、HE染色证实模型成功后.将5-溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记的BMSCs、N1H3T3细胞由颈内动脉进行移植,2周后,Fisher344大鼠灌注固定取脑,免疫组织化学检测BMSCs的趋向迁移规律.结果 体外分离培养的3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性;BMSCs在体外能够向9L细胞迁移;立体定向法建立Fisher344大鼠/9L细胞脑胶质瘤模型符合胶质瘤的特征:颈内动脉移植的BMSCs也能够向9L细胞胶质瘤趋向迁移,主要分布在肿瘤组织与正常组织的边界.结论 BMSCs在体内、外均能够向脑胶质瘤迁移,颈内动脉移植是一种简单、有效的方法.     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型,观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型;待术后生长至3w和4w时行MRI检测;不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4.03w;对照组平均生存时间为3.88w;且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围,对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用,可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

VP_(22)修饰的CD基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6脑胶质瘤体外实验研究

目的 探讨病毒蛋白VP_(22)在胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6胶质瘤中的作用.方法 质粒pAdTrack-CMV-CD中PCR获取CD片段,克隆到慢病毒(lentivirus)质粒pHIV-EGFP和pHIV-VP_(22)-EGFP载体上,获得重组质粒pHIV-CD-EGFP和pHIV-VP_(22)-CD-EGFP,采用酶切和PCR技术进行鉴定.病毒包装采用三质粒系统共同转染293T细胞.CD基因的表达采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法鉴定.Lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP四种慢病毒感染经体外原代培养、扩增的SD大鼠胎脑神经干细胞(Nerual stem cells,NSCs),体外与C6细胞按1:1比例共培养,并加入终浓度100 mg/L的5-氟胞嘧啶(5-FC)培养3 d后,MTT比色法测定细胞存活率.结果 酶切和PCR证实,重组的慢病毒中含有CD基因.慢病毒lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP分别感染NSCs后与C6细胞共培养,在5-FC作用下,其细胞存活率分别为(95.57±4.83)%,(49.96±7.19)%,(94.25±4.32)%和(28.06±6.26)%.统计学处理,转染lentivirus-CD-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP组的细胞存活率明显低于其相应对照组lentivirus-EGFP和lentivirus-VP_(22)-EGFP(P<0.01);其中转染lentivirus-VP_(22)-EGFP组的细胞存活率又明显低于lentivirus-EGFP组(P<0.01).结论 VP_(22)能够在体外增强CD基因修饰的NSCs抗C6胶质瘤疗效.     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

骨髓间充质干细胞趋脑胶质瘤性迁移机制的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）向脑胶质瘤选择性迁移的可能机制。方法从大鼠骨髓组织中分离培养MSC。选取第3-4代MSC,与胶质瘤细胞共培养或利用胶质瘤细胞条件培养基进行诱导培养,倒置相差显微镜下观察培养后MSC的细胞形态学变化：采用细胞免疫荧光染色方法检测培养后MSC表达内皮细胞标志物KDR、Ⅷ因子的情况。结果与胶质瘤细胞共培养和利用胶质瘤细胞条件培养基诱导培养后的MSC在形态上均表现出内皮细胞特征,细胞免疫荧光染色显示KDR、Ⅷ呈阳性表达。结论胶质瘤细胞能够诱导MSC分化为血管内皮细胞样细胞,这可能与MSC的趋胶质瘤性迁移的特性密切相关。     

转染TRAIL的神经干细胞对神经胶质瘤凋亡的诱导作用

神经干细胞对颅内胶质瘤有很强的趋向作用，而对正常脑组织无此特性。TRAIL能选择性地促使肿瘤细胞凋亡而对正常组织无毒性。本文就神经干细胞、TRAIL及神经干细胞转染TRAIL后与胶质瘤的关系作一综述。