人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

结缔组织生长因子腺病毒载体的构建及其对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的构建结缔组织生长因子(CTGF)腺病毒载体并观察其对血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法将CTGF基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CTGF,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒pAd-CTGF,酶切后用转染HEK293细胞包装成重组体腺病毒Ad-CTGF,扩增和纯化后PCR鉴定。应用Ad-CTGF感染VSMCs,划痕实验观察上调CT-GF表达对VSMCs迁移的影响。结果 Ad-CTGF感染HEK293细胞后,随时间增加HEK293细胞表达绿色荧光的量也增加。PCR鉴定重组腺病毒Ad-CTGF电泳结果显示,1 047 bp附近有一条带,与目的片段相符合,CTGF碱基序列经测序正确。Ad-CTGF感染VSMCs后CTGF高表达,创口愈合指数明显提高,VSMCs迁移受到明显提升。结论成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体,上调CTGF表达可以明显增加VSMCs的迁移能力。     

大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠线粒体蛋白ANT1基因的腺病毒载体,并检测其在体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 将大鼠线粒体膜蛋白腺(嘌呤核)苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)1基因片段克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV上,在细菌中将穿梭质粒和pAdXsi载体进行重组,经脂质体转染HEK293细胞对重组腺病毒包装、扩增,用其感染体外培养的VSMC.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,荧光显微镜观察转染效率.用Western印迹检测转染后ANT1在VSMC中的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果表明ANT1基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达2×1011 pfu/ml,Western印迹检测ANT1在VSMC中表达明显高于对照组(P<0.05).结论 成功构建了含大鼠ANT1基因的重组腺病毒载体并在VSMCs有效表达,为以后将Ad-ANT1应用于VSMCs凋亡的研究奠定了基础.     

联合应用泛素分子基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建含有泛素(ubiquitin , Ub)基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0 . 7和GcS0 . 7重组腺病毒. 方法 通过PCR扩增获得Ub基因, 分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7和pShuttle-pCAG-GcS0.7中,进一步通过双酶切将转移载体中的嵌合基因分别克隆入腺病毒载体, 得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7,使用Pac Ⅰ线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测表达产物. 结果 限制性内切酶酶切鉴定、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确. IFA检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达. 结论 成功制备了含有Ub基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重组腺病毒, 为进一步研究联合Ub基因的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础.     

SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒（AdHu5-SV40LT）转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒（AdHu5-SV40LT）。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。     

GSK-3β特异siRNA腺病毒对脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶3B(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,初步探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度.GSK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,Western印迹和免疫细胞化学法检测其对GSK-3β和β-catenin蛋白表达的影响,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖.结果 成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液.构建的重组腺病毒感染HUVEC显著抑制GSK-3β蛋白的表达,增加β-catenin的蛋白表达.重组腺病毒感染3、5、7 d后,细胞增殖率明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 构建的GSK-3β特异的siRNA腺病毒能有效抑制GSK-3β基因的表达,促进β-catenin的蛋白表达,上调Wnt/β-catenin信号通路对人脐静脉内皮细胞增殖有重要的影响.     

人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞（HEK293）中扩增。方法将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒。采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白（GFP）追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度。结果重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符。Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加。hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合。Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合。最终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml。结论成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体。     

大鼠重组腺病毒载体RP105的构建和鉴定

目的构建和鉴定大鼠RP105重组腺病毒载体,并获得具有一定滴度的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。方法 PCR钓取目的基因RP105,连接入穿梭载体GV135(CMV-MCS-EGFP),形成连接产物。连接好的重组腺病毒载体CMV-RP105-MCS-EGFP转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆,对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。采用AdMax腺病毒包装系统,将成功构建的RP105重组腺病毒穿梭质粒与辅助包装质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,得到重组腺病毒,并进行重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定与测序证明本实验成功构建了大鼠RP105重组腺病毒载体。RP105穿梭质粒和腺病毒包装质粒共转染HEK293细胞24h后可见大量绿色荧光蛋白表达和聚集,10d后出现典型的细胞病变,说明腺病毒包装成功。再经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定,重组腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。结论本实验成功构建了携带RP105基因的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。这为下一步研究其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制奠定了实验基础。     

禽流感病毒H5N2亚型A/Chicken/Gansu/2003株HA+NA基因重组腺病毒的构建

目的基于腺病毒可感染禽类呼吸道和肠道上皮黏膜的特性,本文构建了包含有禽流感病毒H5N2亚型HA和NA基因的重组腺病毒,为进一步研制口服禽流感活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法分别扩增出AIV的HA和NA全基因片段,利用拼接接头将HA和NA定向串联并插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV之中,然后在大肠杆菌中实现腺病毒骨架载体pAdEasy-1和重组腺病毒穿梭载体的同源重组,获得插有外源基因的重组腺病毒质粒,进而通过转染HEK293细胞,得到含有目的基因HA和NA的重组腺病毒。结果在pAdTrack-CMV载体中成功克隆了HA+NA双基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组;线性化后的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后可观察到典型的细胞病变和绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有HA+NA双基因重的组腺病毒,为口服活载体疫苗的研制提供了依据。     

人载脂蛋白AⅠ重组腺病毒载体的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建人载脂蛋白AⅠ基因的重组腺病毒载体,探讨人载脂蛋白AⅠ在小鼠体内的表达,建立人载脂蛋白AⅠ过表达小鼠模型。方法采用基因工程技术从重组质粒pDNR-LIB-apoAⅠ-PA获得人载脂蛋白AⅠ基因,插入穿梭质粒pshuttle CMV后,在细菌内与pAdEasy-1进行同源重组,经脂质体转染HEK293细胞,在细胞内包装获得腺病毒颗粒AdV-AⅠ,并进行大量扩增和纯化。纯化的腺病毒经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,通过双向琼脂免疫扩散反应、免疫比浊法及免疫印迹法检测人载脂蛋白AⅠ在小鼠体内的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体,纯化后的病毒滴度达4.0×1013pfu/L。重组腺病毒载体能在小鼠体内高表达人载脂蛋白AⅠ,且在注射1天后表达高达740±110 mg/L。结论成功构建了重组腺病毒载体,并能介导外源基因人载脂蛋白AⅠ在小鼠体内的表达,建立了人载脂蛋白AⅠ过表达小鼠模型,为进一步研究载脂蛋白AⅠ的抗内毒素功能奠定了基础。     

Pathogenesis of carcinoma of the papilla of Vater

Most adenomas and carcinomas of the small intestine and extrahepatic bile ducts arise in the region of the papilla of Vater. In familial adenomatous polyposis (FAP) it is the main location for carcinomas after proctocolectomy. In many cases symptoms due to stenosis lead to diagnosis at an early tumor stage. In about 80%, curative intended resection is possible. Operability is the most relevant prognostic factor. Most ampullary carcinomas resp. carcinomas of the papilla of Vater develop from adenomatous or flat dysplastic precursor lesions. They can be sited in the ampulloduodenal part of the papilla of Vater, which is lined by intestinal mucosa. They also can develop in deeper parts of the ampulla, which are lined by pancreaticobiliary duct mucosa. Intestinal-type adenocarcinoma and pancreaticobiliary-type adenocarcinoma represent the main histological types of ampullary carcinoma. Furthermore, there exist unusual types and undifferentiated carcinomas. Many carcinomas of intestinal type express the immunohistochemical marker profile of intestinal mucosa (keratin 7?, keratin 20+, MUC2+). Carcinomas of pancreaticobiliary type usually show the immunohistochemical profile of pancreaticobiliary duct mucosa (keratin 7+, keratin 20?, MUC2?). Even poorly differentiated carcinomas, as well as unusual histological types, may conserve the marker profile of the mucosa they developed from. These findings underline the concept of histogenetically different carcinomas of the papilla of Vater which develop either from intestinal- or from pancreaticobiliary-type mucosa of the papilla of Vater. Molecular alterations in ampullary carcinomas are similar to those of colorectal as well as pancreatic carcinomas, although they appear at different frequencies. In future studies, molecular alterations in ampullary carcinomas should be correlated closely with the different histologic tumor types. Consequently, the histologic classification should reflect the histogenesis of ampullary tumors from the two different types of papillary mucosa.     

Demonstration of the mechanism of action of biguanides

Summary Palmitic acid oxidation in rat diaphragm homogenate is depressed by biguanide concentrations that are still incapable of inhibiting oxidative phosphorylation. Glucose oxidation is not directly effected by the same biguanide concentrations: however, the inhibitory effect of palmitic acid on glucose oxidation is partly removed by biguanides. Inhibition of fatty acid oxidation, which accounts for most of the metabolic effects caused by these drugs, can be regarded as the fundamental mechanism of action of biguanides. There is some evidence suggesting that these drugs might interact with carnitine, thus preventing long-chain fatty acids from being transported across the mitochondrial membrane to the site of oxidation. Traduzione a cura degli AA.     

胰岛素瘤的解剖分布特点分析

目的胰岛素瘤是最常见的胰腺神经内分泌肿瘤，因其临床表现多样，导致诊断困难。影像学诊断尤其是超声内镜(EUS)在胰岛素瘤的诊断中起着重要作用，拥有较高的敏感性和特异性。本研究拟通过明确胰岛素瘤的解剖分布特点，以期有助于提高影像学的诊断准确率和降低漏诊率，尤其是在教育和培训实践中对于EUS的学习者更具有指导价值。 方法回顾性分析解放军总医院第一医学中心病案资料数据库1993年1月至2019年11月经外科手术、病理确诊为胰岛素瘤的患者的临床资料，检索方法采取搜索术后病理诊断为"胰岛素瘤"的病例，通过查阅病例的方法，提取出胰岛素瘤的大小和解剖分布等数据，进一步分析其特点。 结果共检索到确诊为胰岛素瘤的患者116例，其中，男45例、女71例，年龄13～76岁，平均年龄(44.4±14.85)岁。胰岛素瘤单发110例(94.8%)、多发6例(5.2%)。位置分布：头颈部46例(39.7%)，单发45例、多发1例；体尾部68例(58.6%)，单发65例、多发3例；全胰腺多发2例(1.7%)。病变大小特点：最大径0.4～3.4 cm，平均大小(1.53±0.58)cm。≤1 cm 29例、>1 cm而≤1.5 cm41例、>1.5 cm而≤2.0 cm28例，≤3 cm 15例，>3 cm 3例。年龄与肿瘤的大小相关，≤44岁患者肿瘤平均大小为(1.36±0.51)cm、>44岁患者肿瘤平均大小为(1.70±0.60)cm，P<0.05。头颈部的肿瘤大于体尾部的肿瘤，头颈部肿瘤平均大小(1.66±0.63)cm，体尾部(1.42±0.52)cm，P<0.05。 结论胰岛素瘤在胰腺体尾部较头颈部更好发；绝大多数单发，但可以全胰腺多发；多数小于1.5 cm，肿瘤的大小与患者年龄和肿瘤的解剖分布相关。     

氯硝柳胺悬浮剂的毒性评价

目的评价氯硝柳胺悬浮剂的毒性，为现场大规模应用灭螺提供依据。方法按照中华人民共和国国家标准GB 15670-1995《农药登记毒理学试验方法》和鱼类毒性试验方法进行。结果经口、经皮肤的LDso雌、雄性大鼠均>5 000 mg/kg，经呼吸道的LCso雌、雄性大鼠均>5 000mg/m3，该药经口、经皮肤、经呼吸道毒性均属微毒类药物；兔眼用药后，观察期内无不良反应，对眼无刺激性；皮肤用药后对皮肤无刺激性。与氯硝柳胺原药、氯硝柳胺乙醇胺盐原药和氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂相比，氯硝柳胺悬浮剂对鱼急性毒性最低。结论氯硝柳胺悬浮剂属微毒类药物，对鱼的毒性低于其乙醇胺盐可湿性粉剂，适合于现场应用。     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.     

血吸虫童虫生长发育及其机制的研究进展

血吸虫童虫是宿主免疫系统攻击的重要靶标,包括皮肤型、肺型和肝门型童虫。宿主分子对童虫生长发育具有重要作用。童虫生长发育机制包括免疫调节、信号转导、性别发育及凋亡等。肌动蛋白、组织蛋白酶、烯醇化酶和葡萄糖基转移酶等分子为血吸虫童虫生长发育的重要分子。本文对血吸虫童虫生长发育及其机制的研究进展做一综述。     

124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法对124例耐多药结核分枝杆菌以及50株敏感株的耐药相关基因(包括异烟肼inh A、kat G、oxyR-ahp C间隔区以及利福平rpo B)进行序列测定,分析其基因突变情况。结果异烟肼耐药inh A基因突变率为14.5%;kat G基因突变率为70.2%(87/124),主要位于315位;oxyR-ahp C间隔区突变率为15.3%;inh A、kat G两种基因同时突变率75.0%,三种基因同时突变率为89.5%。利福平rpo B基因突变的检出率高达95.2%,突变主要发生在531、526、516位点。结论我省耐多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为kat G 315、inh A C-T(-15)、axyR-ahp C间隔区(-10)C-T,利福平为rpo B531、526、516。结合MDR-TB耐药相关基因的特征分析,可以建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核菌耐多药性的新方法。     

Assessment of quality of life of parents of children with juvenile chronic arthritis

The aim of the study was to assess the quality of life (QOL) and the psychological status of parents of children with juvenile chronic arthritis (JCA). The QOL, anxiety and depression of the parents of 28 children with JCA were evaluated and compared to those of the parents of 28 healthy children. Mothers of JCA children and mothers of healthy children reported similar QOL. The reported anxiety and depression levels were similar for mothers and fathers in both groups. The parents of children with pauciarticular-type JCA reported lower QOL and higher levels of anxiety and depression than the parents of children with other types, namely polyarticular and systemic JCA. These findings may be explained by the fact that the pauciarticular patients had shorter disease duration and were less frequently seen in the outpatient clinic. The QOL of mothers of children with JCA was found to be slightly impaired in the group of children with pauciarticular JCA. Future larger studies are needed to confirm these results, as the number of subjects in the three groups was rather low. Received: 26 September 2001 / Accepted: 8 February 2002     

CagA-Hp抗体IgG与胃炎的组织学分析

研究幽门螺杆菌(Hp)感染与胃炎的关系。方法对204例慢性胃炎患者胃粘膜进行观察分析,并测定其中137例Hp阳性患者血清CagA-Hp抗体IgG水平,与组织学对照。结果慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者血清CagA抗体IgG明显高于对照组(P＜0.01);其他类型胃炎患者血清CagA抗体IgG水平无明显增高(P＞0.05)。结论CagA-Hp可能是导致慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生的因素之一,对这类患者应密切随访观察。     

慢阻肺急性加重期患者预后的影响因素分析

目的探讨慢性阻塞性肺病急性加重期(AECOPD)患者预后的相关危险因素。方法回顾性调查、收集58例AECOPD患者可能影响其预后的相关因素,并对其分别进行单因素分析。并进行Logistic多元逐步回归进行多因素分析,筛选影响AECOPD患者预后的独立危险因素。结果单因素分析后将结果 P0.1的因素纳入多因素Logistic回归,分析发现是否合并呼吸衰竭、气促程度、白细胞计数、APACHEⅡ、应用抗氧化剂、慢阻肺治疗依从性为影响AECOPD患者预后不佳的独立因素(P0.05)。结论根据AECOPD患者预后的独立危险因素,及早判断,选择合适的后续治疗方案,对提高其生存率及生存质量具有重要意义。