重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

结核分枝杆菌19-kDa蛋白在大肠杆菌中的表达

目的通过基因工程技术获得重组结核分枝杆菌19-kDa蛋白。方法应用PCR技术扩增结核分枝杆菌H37Rv19-kDaDNA序列;以质粒pET24b为表达载体,构建19-kDa重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。结果重组质粒pET24b-19-kDa测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆菌19-kDa蛋白诱导3~4h重组蛋白在大肠杆菌中的表达量最高。结论pET24b-19-kDa大肠杆菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19-kDa蛋白。     

人PRX3原核表达质粒的构建及表达

目的 构建人Peroxiredoxin 3（PRx3）原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用基因工程技术将PRX3编码序列插入原核表达质粒载体pET-30（a），再将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。结果 酶切鉴定和DNA测序证实人PRX3编码序列全长正确地插入表达质粒中，序列与GenBank报道的一致；重组PRX3在大肠杆菌获得高效表达，且易形成包涵体。结论 人PRX3原核表达质粒构建成功，并能在大肠杆菌中高效表达，为后续研究奠定了良好基础。     

淋球菌外膜蛋白NspA基因重组子的构建与表达

目的构建淋球菌标准株外膜蛋白NspA基因重组子,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达外膜蛋白NspA。方法提取淋球菌标准株基因组DNA,PCR扩增其NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c（＋）中,构建pET-NspA重组子,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建了淋球菌标准株的pET-NspA大肠杆菌表达重组子,经IPTG诱导表达后,该蛋白在大肠杆菌中高效表达。结论淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中的成功表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防淋病的疫苗奠定了基础。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

变形链球菌唾液结合区段(SBR)在大肠杆菌中的表达

目的构建含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109(DE3)中诱导表达。方法采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因插入表达载体pcMVT 7,构建重组原核表达质粒pcMVT 7-SBR,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化SBR目的蛋白。结果经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒pcMVT 7-SBR序列及阅读框架正确,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。结论成功构建了含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

[目的]构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒，并检测在大肠杆菌BL21/DE3中的表达情况。[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNAS中扩增Pf332基因（Pf332)片段，P332-R0、P332-R2，并分别插入pGEX4T-1原核表达载体，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定，用DNAstar软件对FCC1/HN株与3D7株Pf332和P332-R1、P332-R2片段进行同源性比较，由IPTG诱导在大肠杆菌BL21/DE3中表达重组蛋白。[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，大小分别为489，429和393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的pGEX-P332-R0,pGEX-P332-R1,pGEX-P332-R2重组质粒，序列分析结果显示，与3D7株相比，FCC1/HN株P332-R1、P332-R2片段编码多肽分别缺少2、4个相应的重复单元，在大肠杆菌BL21/DE3中表达出3个重组蛋白，相对分子质量分别为46、44和42。[结论]扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，并在大肠杆菌BL21/DE3中成功表达，FCCl/HN株与3D7株的P332-R1、P332-R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

人DNMT3B7原核表达载体的构建和表达

目的:构建人类DNA甲基转移酶(DNMT)3B7原核表达载体,并进行初步表达。方法:根据Genebank中人DNMT3B7 cDNA序列设计并合成特异性引物;提取HCT116细胞总RNA并进行反转录,利用PCR技术扩增出DNMT3B7;将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定;然后将重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果:PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-4T.3-DNMT3B7;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示目的蛋白在E.coli BL21中高效表达,分子量约为40 kD。结论:成功构建了人DNMT3B7原核表达载体,完成了其在E.coli BL21中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达

目的构建人DNMT3B1原核表达载体,并进行初步表达。方法据Genebank中人DNMT 3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果 PCR扩增得到人DNMT 3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-DNMT3B1I,PTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中高效表达,相对分子质量约为100 kd。结论成功构建了人DNMT3B1原核表达载体并完成其在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白，制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a（＋）-ING4，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a（＋）-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白10％以上，以包涵体形式存在，纯化后其纯度可达70％以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达

目的：对木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因(nir)进行克隆并表达,并测定酶的活力,探讨亚硝酸盐还原酶(NiR)对亚硝酸盐的降解特性。方法：提取木糖氧化产碱菌DNA,根据GenBank公布的nir基因序列设计引物,利用PCR技术扩增nir基因,克隆至表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-nir,通过双酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白。将细胞发酵液超声破碎,提取粗酶,测定酶活力。结果：经PCR扩增及测序鉴定得到长度为1 083 bp的目的片段;经终浓度0.6 mmol?L-1IPTG、30℃诱导表达5 h,获得相对分子质量为37 000的重组蛋白;在pH6.5、反应温度35℃时,测得酶活力为51.74 U•mL^-1。结论：成功克隆nir基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,且表达产物有酶活。