积累5-甲基四氢叶酸双抗突变株的选育及条件优化

目的 选育积累5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的双重药物抗性高产突变株,探讨发酵时间和温度对叶酸积累形式的影响.方法 紫外线和EMS联合诱变;磺胺、甲氨蝶呤药物培养基筛选菌株;单因素实验检测发酵条件对叶酸积累形式的影响;HPLC检测叶酸含量和存在形式.结果 获得稳定性良好的抗性突变株,其叶酸产量是原始菌株的2.2倍.适合5-MTHF积累的发酵时间为16 h,积累量为68.94 μg/g干菌.结论 抗性突变株能提高菌株产叶酸能力,5-MTHF含量受发酵时间影响大,而发酵温度对产物形式和产量影响不显著.     

产叶酸菌株的筛选及其发酵条件的优化

从土壤样本中筛选分离得到的菌株R-1和S-1具有产叶酸的能力,进行单因素实验和正交分析,优化碳源、氮源、初始pH、发酵时间等条件,叶酸产量提高约为10%;加入前体物质对氨基苯甲酸(PABA),菌株R-1和S-1产叶酸的能力显著提高,分别提高了2倍和1.8倍;最后进行正交分析得出各菌种的最佳发酵产叶酸的因素选择。结果显示,菌株R-1的最佳产叶酸条件是葡萄糖25g/L,柠檬酸铵4g/L,PABA0.3g/L,接种量2%,培养时间24h,初始pH6.5,叶酸产量达到了1.92μg/mL;菌株S-1最佳产叶酸条件是蔗糖20g/L,柠檬酸铵2g/L,PABA0.3g/L,接种量3%,培养时间48h,初始pH5.5,叶酸产量为1.31μg/mL。     

增强海藻糖胞内积累提高大肠杆菌耐受性与乙醇产率

为提高产乙醇大肠杆菌对发酵底物和乙醇的耐受性,并提高乙醇发酵性能,以大肠杆菌B0013-1031H为出发菌株,对其海藻糖代谢途径进行改造,获得了敲除海藻糖分解途径的突变株JC31和进一步加强海藻糖合成途径的突变株JC41。突变株JC31和JC41较出发菌株都具有更高的海藻糖合成与积累能力,其中JC41的胞内海藻糖含量可达出发菌株的12倍。与出发菌株相比,突变株JC31和JC41对葡萄糖和乙醇胁迫的耐受性显著提高。进一步引入乙醇合成途径,在葡萄糖质量浓度120 g/L的发酵条件下,菌株JC31-PA表现出最优的发酵性能,其最大乙醇产量为50. 6 g/L,较对照菌株提高了5. 42%;乙醇转化率为48. 72 g/100 g葡萄糖,较对照提高了12. 67%,达到理论转化率的95%。     

玉米中5-甲基四氢叶酸提取方法的优化及高效液相色谱法定量分析

优化玉米中5-甲基四氢叶酸(5-methyl-tetrahydrofolate,5-MTHF)提取方法,评价高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定玉米5-MTHF含量的准确性。结果表明:优化最佳提取参数为叶酸提取液pH值为6.5,α-淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清的添加量分别为12 U/mL、0.028 U/mL、14μL/mL,固相萃取净化柱收集洗脱液2.5 mL;HPLC法测定玉米中5-MTHF表明,在0.003～1.000μg/mL有良好的线性关系,相关系数为0.999 9,检出限为0.001μg/mL,定量限为0.003μg/mL,精密度为1.90%,样品加标平均回收率为104.57%;测定叶酸强化玉米(京科糯928)中5-MTHF与总叶酸含量分别为181.18μg/100 g与253.65μg/100 g(干质量),提取优化后的HPLC检测方法适用于玉米中5-MTHF与总叶酸的测定,可为其他强化谷物中叶酸含量的测定提供参考。     

9个柑橘品种不同组织中5-甲基四氢叶酸含量的比较

以9个不同种和品种柑橘为试验原料,采用反相高效液相荧光检测法(RP-HPLC-FLD)测定不同柑橘品种中各组织5-甲基四氢叶酸的含量。结果表明:甜橙类果实果肉中含5-甲基四氢叶酸最高,尤以哈姆林甜橙最高,为29.28μg/100 g;其次为柚类,沙田柚果肉中5-甲基四氢叶酸的含量为23.45μg/100 g,梁平柚15.01μg/100 g;柑类品种果实果肉5-甲基四氢叶酸的含量较低,早津温州蜜柑果肉中的5-甲基四氢叶酸含量为15.58μg/100 g,台湾椪柑8.92μg/100 g;柠檬中的含量最低,只有4.1μg/100 g。大多数品种中,不同组织5-甲基四氢叶酸含量的基本排序为种子>果肉>囊衣>果皮。从整体上看,甜橙类果实中5-甲基四氢叶酸的含量最高。     

高产γ-氨基丁酸霉菌菌株的筛选及诱变育种

以霉菌作为出发菌株,将其接入大豆-水(3:5,m/V)的发酵培养基中进行发酵,根据发酵过程中γ-氨基丁酸(GABA)产量,筛选出GABA的高产霉菌菌株,然后利用紫外线对高产菌株进行诱变处理,并通过抗性初筛获得长势较好的突变菌株,再分别利用含有质量浓度为1g/100mL L-谷氨酸的PDA综合培养基和大豆水溶液的发酵培养基进行两次筛选,得到稳定高产GABA突变菌株。结果表明,通过对产GABA霉菌菌株的筛选,得到米曲霉3.800为高产GABA霉菌,GABA产量达到0.674g/L。以米曲霉3.800作为原始菌株,对其进行紫外诱变处理,从而获得高产GABA突变菌株,结果表明,利用紫外线对米曲霉3.800进行处理的最佳照射时间为2min。在此照射时间下,通过突变菌株在含有质量浓度为1g/100mL L-谷氨酸的PDA综合培养基和大豆-水溶液的发酵培养基进行两次筛选,最终获得一株稳定的高产GABA突变菌株3.800-4,其在含有质量浓度为1g/100mL谷氨酸的PDA综合培养基中的GABA产量为4.491g/L,比原菌株的GABA产量提高了23.58%;同时其在大豆-水的发酵培养基中的GABA产量为0.874g/L,比原菌株的产量提高了29.67%。     

酵母菌发酵制备叶酸功能食品的研究

从筛选出的一株酵母菌为发酵菌株,研究其高产叶酸的发酵条件和加工合理性。对所含叶酸及氨基酸等进行了检测,制成叶酸功能食品。     

乳酸菌发酵代谢合成叶酸的影响因素

对嗜酸乳杆菌以及乳酸乳球菌发酵合成叶酸的影响因素进行了研究。结果表明,乳酸菌代谢合成叶酸的产率为17~100μg/L,菌种、培养时间、pH值、对氨基苯甲酸(PABA)质量浓度会影响乳酸菌合成叶酸的产量。与乳酸乳球菌乳酸亚种相比,嗜酸乳杆菌CH-2生成的叶酸产量要高。不同菌株生成叶酸的能力与pH值有关,嗜酸乳杆菌在pH值为4.2叶酸产率明显下降,乳酸乳球菌乳酸亚种产叶酸的能力则不受pH值影响。添加PABA可以显著提高乳酸菌的叶酸产率。选择适宜的乳酸菌菌株,优化发酵工艺参数可以提高乳及相关食品中叶酸的质量浓度,达到生物方式强化叶酸的效果。     

产纤溶酶菌株根霉12~#的诱变育种及固态发酵培养基的优化

以产纤溶酶的菌株根霉 12 # 为出发菌株 ,对其进行紫外线 氯化锂复合诱变 ,筛选到74株制霉素抗性突变株。所有抗性突变株经进一步固态发酵筛选 ,获得了 4株稳定高产纤溶酶的正突变株 ,其纤溶酶产量分别比出发菌株提高 3 2 9%、2 1 5 %、2 2 3 %和 18 0 %。以其中的 1株为菌种 ,研究了固态发酵产生纤溶酶的培养基组成。采用单因素试验、均匀设计方法对固态发酵培养基的碳源、氮源、碳氮比、初始pH、加水量、无机盐加量进行了优化。结果表明 ,实验范围内根霉 12 # 固态发酵产生纤溶酶的适宜培养基组成为 :m (麸皮 )∶m (豆粕 )=1∶2 ,初始 pH5 0 ,加水量 0 75mL/g物料 ,MnSO4·H2 O和 (NH4) 2 SO4加量分别为 0 2 5 %和1 42 % (对物料 )。优化条件下的固态发酵纤溶酶产量平均达 744 5 7U/g物料。     

高产辅酶Q10光合细菌的选育

以球形红假单胞菌1．1737^T为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,并结合罗红霉素抗性和耐前体性物质-对羟基苯甲酸抗性突变株的筛选,获得1株辅酶Q10高产菌株PHB^r-2,该菌株经发酵108h的生物量为15．7g／L,辅酶Q10产量达到50．6mg／L,比原始菌株在同样条件下产量提高了90．9％。该变异株遗传性能稳定,经转接5代后其辅酶Q10产量为49．5mg／L,是1株很有前景的辅酶Q10生产菌株。     

高产大豆异黄酮糖苷转化酶乳酸菌的筛选及其发酵条件的优化

采用高效液相色谱法测定发酵豆乳中游离型大豆异黄酮含量,以此为指标,从传统发酵食品分离筛选的100株乳酸菌中,选出一株发酵后游离型大豆异黄酮产量最高的作为生产功能性发酵豆乳的发酵菌株。经生理生化及遗传学特性鉴定该菌株为植物乳杆菌。并通过单因素和响应面优化实验对影响游离型大豆异黄酮产量的3个发酵因素,即发酵时间、发酵温度、接种量,进行优化,得出最佳发酵条件为:发酵温度45℃、发酵时间17h、接种量5%,在此条件下游离型异黄酮的产量为132.814μg/mL。     

甘蔗糖蜜发酵培养高铁营养酵母的菌种诱变选育

经过抗性筛选和摇瓶发酵培养，从25株酵母菌中筛选到一株能以甘蔗糖蜜为碳源的生物量较高及富铁能力较强的菌株R4—5。利用^60Co辐射诱变，选育出一株正突变菌株R4—5—27，在同等发酵条件下，生物量达到10．25mg／L，铁含量7．43mg/g，总铁含量为76．16mg/L，比出发菌株提高了1．59。连续10次传代，其产量性状无大变化，表明该菌株遗传性状稳定，极有潜力改良为工业化生产菌种。     

纳他霉素高产菌株的选育及其发酵条件的研究

利用链霉素抗性突变选育纳他霉素高产菌株 ,即将经过紫外线诱变处理的纳他霉素(natamycin)产生菌褐黄孢链霉菌 (Streptomycesgilvosporeus)ATCC1 332 6菌株孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度 (0 6μg/mL)的培养基平板上 ,获得了 1 2 2株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有 1 3株。其中突变株SG 56的生产能力比出发菌株提高到 1 4 6 % ,研究了其发酵性能 ,优化了培养基组成和发酵工艺条件 ,使纳他霉素产量提高到 1 70 %。     

高产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件优化

从山西临汾汾河滩涂的表层土壤中分离到22株产蛋白酶菌株,用检测蛋白酶产生水解圈和蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出一株高产蛋白酶菌株P5,并通过正交试验对其产酶条件进行了研究。结果表明,影响P5菌株发酵产酶因素的主次顺序为培养温度、接种量、培养时间;影响P5菌株发酵培养基组成因素的主次顺序为氮源含量、起始pH值、碳源含量;确定的P5菌株的最佳产酶条件为,在以30 g/L葡萄糖为碳源,50 g/L蛋白胨为氮源,起始pH7.0的最适产酶培养基中,培养温度35℃,接种量为8%的条件下发酵培养48 h,具有最大产酶量,其蛋白酶活力可达129.2 U/mL。     

产叶酸乳酸菌的筛选及对发酵乳的影响

为筛选出高产叶酸的乳酸菌并研究该乳酸菌对发酵乳的影响,采用高效液相色谱(HPLC)法从5种乳酸菌菌株:植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的发酵液中检测叶酸含量,并通过检测复合发酵乳的pH、持水力、质构特性和感官特性来研究产叶酸的乳酸菌对发酵乳品质的影响。结果表明:植物乳杆菌产叶酸量最高,其次是嗜酸乳杆菌,分别为51.40和34.77 μg/mL。并且以基础菌发酵乳为对照组,添加产叶酸乳杆菌发酵乳为实验组,实验组与对照组相比,其质构特性和感官品质会提高,同时pH也显著下降(p<0.05)。本实验为开发功能性发酵乳提供了一定的理论依据。     

高强度产甘油假丝酵母突变株的选育及其发酵性状

以一株产甘油假丝酵母为出发菌株 ,采用化学诱变 ,通过玉米浆和外加无机磷组成的磷质量浓度为 3 40mg/L的磷源选择培养基 ,得到了一株发酵时间较原菌株缩短了 8h左右 ,产甘油能力 (甘油产量约为 1 40 g/L ,甘油转化率为 5 6% )和原菌株相似的突变株 ,并研究了突变株的发酵性状 .     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

MPMS诱变结合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对菌株ASAGF 13-8-1进行诱变,并通过链霉素、庆大霉素、利福平、氯霉素四种抗生素抗性筛选多杀菌素高产菌株。利用96孔板发酵培养结合生物检测的快速方法进行高产菌株高通量初筛,摇瓶发酵进行复筛。通过5轮复筛验证,获得1株产量较出发菌株提高28.68%且遗传稳定的突变菌14-2。比较MPMS诱变和MPMS诱变结合0.9μg/mL链霉素、14μg/mL庆大霉素、400μg/mL利福平、2μg/mL氯霉素的四重抗性筛选对出发菌株ASAGF 13-8-1的作用效果,结果显示MPMS诱变结合抗生素抗性筛选更有利于多杀菌素高产菌株的选育。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育

研究以酸奶生产菌株嗜热链球菌S2为出发菌株。采用自然选育的方法筛选出其抗噬菌体突变株。获得4株生产性能较好的抗噬菌株KS21、KS22、KS23、KS24,溶源性检测其为非溶源菌。对4株抗性菌株进行20次传代和酸奶发酵实验,结果表明抗性稳定,其中KS23发酵酸奶产酸达109°T,凝乳时间与出发菌株相当。细胞全蛋白SDS-PAGE电泳分析显示突变菌株与出发菌株在某些蛋白表达上有所差异,可能是抗性产生的原因。