骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的初步研究

目的建立成人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外培养和扩增的方法，探讨其生物学特性，建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法取正常成人骨髓5ml，用Pereoll分离液（密度1．073g／ml）经密度梯度离心法分离得到单个核细胞，以2×10^5个细胞／cm^2的密度接种于含10％新生牛血清的LG-DMEM培养液。经培养、扩增后，应用倒置相差显微镜观察其形态，MTT法测定生长曲线，流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期的检测，并在透射电镜下观察其超微结构。结果培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一，为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观，生长曲线示其增殖能力强。流式细胞仪检测显示有90％以上的细胞处于G0／G1期，表面标记物中CD44表达阳性，而造血细胞表面标志CD3、CD4、CD7、CD13、CD14、CD15、CD19、CD22、CD33、CD34、CD45和与移植排斥发生密切相关的HLA—DR表迭阴性。超微结构显示细胞内有丰富的粗面内质网，细胞器发达。结论所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群，具有MSCs的生物学特性，可作为组织工程中的种子细胞。     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景：体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等，而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢.目的：研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效。设计：以细胞为研究对象，重复观察测量，探索性研究.单位：一所医学院病理生理学教研室。材料：实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，流式细胞仪检测其表面抗原表达，多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志：主要观察指标：①MSCs分离和扩增结果。②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果。结果：大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD14，CD11α，C34，CD38，CD45，CD80，CD86为阴性，CD29，CD44，CD90，CD105，CD166呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性，胶质纤维酸性蛋白阴性。结论：SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的诱导条件下，可以分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓MSCs表面分子检测及诱导分化研究

目的通过建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离培养方法，探讨大鼠MSCs表型特征以及多向分化潜能。方法利用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓MSCs，传代扩增，进行形态学观察，测定生长曲线。免疫细胞组织化学及流式细胞分析检测细胞表面分子的表达。定向诱导MSCs向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。结果原代分离的MSCs在接种后48h贴壁，细胞形态为椭圆形，多角形及短梭形，12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增，细胞进一步纯化，细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列，而且生长速率加快，Pl代细胞群体倍增时间为20．3h。细胞免疫组化结果显示P2代细胞表面分子CD44、FN表达阳性，而CD14、CD34阴性，流式细胞检测CD44、FN阳性率分别为92．09％和90．55％。不同诱导剂定向诱导2周，经油红O、阿新兰及茜素红S染色鉴定，P3代MSCs分别向脂肪细胞，软骨细胞及成骨细胞分化。结论通过密度梯度离心结合贴壁筛选方法，体外分离培养的大鼠骨髓MSCs具有很强的增殖能力，并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

胎儿骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的:分离培养胎儿骨髓间充质干细胞(fetus mesenchymal stem cells,fMSCs),分析其基本的生物学特征,如形态特征、增殖特性、细胞表型和多向分化潜能以及核型分析等,为其临床应用提供理论依据.方法:淋巴细胞分离液分离胎儿骨髓MSCs,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记的变化情况,并进行不同生长时期的核型分析、细胞周期检测等.结果:在扩增过程中,MSCs的增殖能力随着代数增加而降低.在扩增至第3代时,MSCs表现出较高的纯度,表达CD29、CD44、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.10代之前核型未发生变异,仍具成骨成脂分化能力,细胞周期分析显示其仍具有干细胞特性.结论:在体外培养条件下,10代以前的细胞生长性状稳定,可作为组织工程等临床应用的良好对象.     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等,而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢?目的研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效.设计以细胞为研究对象,重复观察测量,探索性研究.单位一所医学院病理生理学教研室.材料实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠.方法通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养,流式细胞仪检测其表面抗原表达,多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志.主要观察指标①MSCs分离和扩增结果.②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果.结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.流式细胞仪检测结果显示CD14,D11α,D34,D38,D45,D80,D86为阴性,D29,D44,D90,D105,D166呈阳性.黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3 h后大部分MSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性,胶质纤维酸性蛋白阴性.结论SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的诱导条件下,可以分化为神经元样细胞.     

系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的：探讨系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞的体外培养方法、生物学功能、表面标记表达的异常与否。方法：选择2004—12/2005—12于南京医科大学第一附属医院风湿科初诊为系统性红斑狼疮患者5例，均为女性，年龄20～35岁，诊断符合美国风湿病学院（ARA）1997年修订的诊断标准，所有患者知情同意后，获取骨髓标本。采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养5例系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞，观察其形态学改变，测定其生长曲线，采用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物及分析细胞周期。结果：5例系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞均分离培养成功，其中1例因出现细菌污染而终止培养。①传代细胞生长较原代要快，细胞在8～10d即可达到90％融合。对P1、P2代细胞生长曲线进行观察，发现这2代细胞具有以下共同特征：传代培养的潜伏期为1～3d，第4天起呈对数增长，至第7天达到高峰，之后进入平台期。②流式细胞术检测问充质干细胞细胞表面抗原显示，细胞高表达CD105、CD13、CD90、CD73，而CD34、CD45、CD38、CD33阴性，3代以后的骨髓间充质干细胞纯度达到了95％以上，基本上排除了骨髓单个核细胞和巨噬细胞的污染。③间充质干细胞的周期分析显示，扩增后的间充质干细胞9．46％的细胞处于S，G2／M期，90．54％处于G0／G1期。结论：系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞体外可有效分离培养，所培养扩增的细胞成分单一，且保持干细胞特性，适于以后临床应用。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养扩增的初步研究

目的:建立成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)体外培养和扩增的方法,探讨其生物学特性,建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法:取正常成人骨髓,用含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增后,进行倒置显微镜观察,测定生长曲线,流式细胞仪行细胞表面抗原检测。结果:培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一,增殖能力强。所获得细胞CD44表达阳性,CD19、CD15、CD45、CD34、CD38、CD4、CD8表达阴性。结论:所建立的分离和培养方法可获取骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,具有MSCs的生物学特性。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的：建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法，探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对MSCs增殖的影响。方法：通过密度梯度离心，贴壁法分离培养人胚MSCs，取第4代MSCs，应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达。采用MTT法观察不同含量和不同作用时间的IGF-Ⅰ对MSCs增殖的影响。结果：体外培养的MSCs呈现成纤维细胞形态，流式细胞仪检测结果显示，MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45。细胞周期分析显示IGF-Ⅰ使S+G2+M期细胞数增加，占细胞总数(29．9&;#177;2.3)％(t=10．4，P&;lt;0.01)。1μg／LIGF-Ⅰ促MSCs增殖作用不明显，10M／LIGF-Ⅰ即可促MSCs增殖，IGF-Ⅰ含量为100μg／L时，其促增殖作用达最大值，吸光度为2．95。而当IGF-Ⅰ含量大于100μg／L时，促细胞增殖作用反而下降；时效关系显示，IGF-Ⅰ第1天发挥促增殖作用，第5天促增殖作用达高峰，维持时间可达7d。结论：外源性IGF-Ⅰ能促进MSCs增殖，为实现MSCs体外快速扩增提供适宜的条件。     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

类风湿关节炎关节液来源的间充质干细胞分离鉴定及其对破骨细胞发育的影响

为了研究炎性微环境对于间充质干细胞生物学特性的影响,从类风湿性关节炎病人关节液中分离得到间充质干细胞,以流式细胞术测定其免疫学表型,以成骨和成脂肪诱导检测其多向分化能力,将其与CD14^＋的单核细胞共同培养并以抗酒石酸的酸性磷酸酶染色检测对破骨细胞的调控作用。结果表明：类风湿性关节炎病人关节液中分离得到的间充质干细胞高达CD105,CD73,CD29,CD44,CD166和HLA—ABC,低表达CD34,CD45,CD31,HLA—DR,CD80和CD86;与健康人骨髓间充质干细胞相比,其向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力下降,而且其支持更多的破骨细胞生成（P〈0．05）。结论：类风湿性关节炎病人关节液中存在的间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表型,但是其多向分化能力下降,更有意义的是其支持破骨细胞生成的能力增强。本研究结果有助于了解病理微环境中的间充质干细胞生物学特性。     

人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法。从正常产妇分娩后的脐带静脉灌注液分离间充质干细胞,观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期,在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化。结果表明:脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样,高表达CD29、HLA-ABC、CD166、CD105、CD73、CD44;不表达造血和内皮标志(CD34、CD45、CD144和CD14)。它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化,符合间充质干细胞的基本功能特征。结论:人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞,能够在体外培养和扩增,可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景：间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。目的：观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。方法：无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105＋/CD29＋/CD44＋/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S＋G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义（P〈0.01）,第3～18代细胞间G0/G1、S＋G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3～18代之间。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景:间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。目的:观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。方法:无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。结果与结论:人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105+/CD29+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P<0.01),第3～18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P>0.05)。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3～18代之间。     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞

本研究探讨间充质干细胞（MSC）分化为心肌细胞（CM）的能力。对大鼠源MSC进行标记并将大鼠源MSC与初生大鼠CM直接接触共培养5—7天，诱导MSC向CM分化。用流式细胞仪检测细胞表面抗原，免疫荧光法检测标记细胞的心肌特异性标记物肌球蛋白和肌钙蛋白T表达。结果显示：体外培养的MSC表达CD90、CD44、CD105、CD54，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞相关抗原。MSC与CM直接接触共培养后可分化为心肌样细胞，表达心肌特异蛋白肌钙蛋白T和肌球蛋白，CM与MSC比例为4：1时，MSC分化为心肌样细胞的比例最高。结论：MSC在与CM直接接触共培养条件下可被诱导分化为心肌样细胞，两种细胞按4：1比例混合培养后MSC分化为心肌细胞的效果最明显：     

人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性

背景：骨髓是间充质干细胞的主要来源,但骨髓中间充质干细胞数量和质量会随着年龄的增长而逐渐降低。因此,寻找一种新的干细胞来源具有重要意义。目的：分离研究了一种新的间充质干细胞来源——人绒毛膜来源间充质干细胞,并研究其生物学特性。方法：将胎盘冲洗干净后,分离出脐带和羊膜组织,将剩余的胎盘组织进行原代和传代培养。通过短串联重复序列分析检测细胞是否来源于绒毛膜,用MTT法检测细胞生长方式,流式细胞仪分析细胞表型及干细胞标记,使用不同的诱导分化培养基检测其多向分化的能力。将该细胞与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平。结果与结论：短串联重复序列分析证明所得到的细胞来源于绒毛膜,这种绒毛膜来源的细胞生长呈典型的成纤维细胞形态。细胞表达常见的间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34。同时,细胞也表达Nestin和Sox-2。在不同的条件培养基培养状态下,细胞可向成骨、成脂方向分化。这些结果证明所得到的细胞为人绒毛膜间充质干细胞。这些绒毛膜间充质干细胞能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素。可见绒毛膜来源的间充质干细胞具有和传统的骨髓来源间充质干细胞具有相似的生物学特性。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.